Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren nabigatzailearen bertsioak CSS euskarri mugatua du. Emaitza onenak lortzeko, gomendatzen dizugu zure nabigatzailearen bertsio berriago bat erabiltzea (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilo edo JavaScript gabe erakusten ari gara.
Produktu naturalen aurkikuntzak eta erabilera onuragarriak gizakien bizitza hobetzen lagun dezakete. Landareen hazkuntza inhibitzen duten produktu kimikoak asko erabiltzen dira belar txarrak kontrolatzeko herbizida gisa. Herbizida mota desberdinak erabili behar direnez, ekintza-mekanismo berriak dituzten konposatuak identifikatu behar dira. Ikerketa honetan, Streptomyces werraensis MK493-CF1-etik datorren N-alkoxipirrol konposatu berri bat aurkitu dugu, kumamonamida, eta sintesi-prozesu osoa ezarri dugu. Jarduera biologikoaren analisi bidez, aurkitu dugu urs-monoamikoa azidoa urs-monoamidaren bitartekari sintetikoa dela eta potentziala...landareen hazkuntza inhibitzailea. Horrez gain, hainbat azido urbenoniko deribatu garatu ditugu, besteak beste, urbeniloxi deribatua (UDA), zeinak jarduera herbizida handia duen HeLa zelulen hazkuntzan negatiboki eragin gabe. Halaber, ikusi dugu azido urmotoniko deribatuek landareen mikrotubuluak eten egiten dituztela; gainera, KAND-ek aktina-harizpiei eragiten die eta zelulen heriotza eragiten du; alderdi anitzeko efektu hauek mikrotubulu-inhibitzaile ezagunen efektuetatik desberdinak dira eta azido ursonikoaren ekintza-mekanismo berri bat iradokitzen dute, eta hori abantaila garrantzitsua da herbizida berrien garapenean.
Produktu naturalen eta haien deribatu onuragarrien aurkikuntza eta aplikazio praktikoa gizakien bizitzaren kalitatea hobetzeko bitarteko bat da. Mikroorganismoek, landareek eta intsektuek sortutako bigarren mailako metabolitoek aurrerapen handiak ekarri dituzte medikuntzan eta nekazaritzan. Antibiotiko eta leuzemiaren aurkako sendagai asko garatu dira produktu naturaletatik. Horrez gain, hainbat mota...pestizidak, fungizidak eta herbizidak ateratzen dira produktu natural hauetatik nekazaritzan erabiltzeko. Bereziki, belar txarrak kontrolatzeko herbizidak tresna garrantzitsuak dira nekazaritza modernoan laboreen errendimendua handitzeko, eta hainbat konposatu mota erabiltzen dira dagoeneko komertzialki. Landareetako hainbat prozesu zelular, hala nola fotosintesia, aminoazidoen metabolismoa, zelula-hormaren sintesia, mitosiaren erregulazioa, fitohormonen seinaleztapena edo proteinen sintesia, herbiziden helburu tipikotzat hartzen dira. Mikrotubulu-funtzioa inhibitzen duten konposatuak landareen hazkuntzan eragina duten herbizida-klase arrunta dira, mitosiaren erregulazioan eragina izanik2.
Mikrotubuluak zitoeskeletoaren osagaiak dira eta oso kontserbatuta daude zelula eukariotoetan. Tubulina heterodimeroa α-tubulina eta β-tubulinaz osatuta dago, mikrotubulu protofilamentu linealak eratuz, 13 protofilamentuk egitura zilindriko bat osatuz. Mikrotubuluek hainbat funtzio betetzen dituzte landare-zeluletan, besteak beste, zelulen forma, zelulen zatiketa eta zelula barneko garraioa zehaztea3,4. Landare-zelulek mikrotubuluak dituzte fase interfazeko mintz plasmatikoaren azpian, eta uste da kortexeko mikrotubulu hauek zelulosa mikrofibrilen antolaketa kontrolatzen dutela zelulosa sintasa konplexuen erregulazioaren bidez4,5. Erroko epidermis-zelulen kortexeko mikrotubuluak, erroaren puntaren luzapen azkarraren eremuan daudenak, alboetan daude, eta zelulosa mikrozuntzek mikrotubulu hauei jarraitzen diete eta zelulen hedapenaren norabidea mugatzen dute, horrela zelulen luzapen anisotropikoa sustatuz. Beraz, mikrotubuluen funtzioa estuki lotuta dago landareen morfologiarekin. Tubulina kodetzen duten geneetan aminoazidoen ordezkapenek kortexeko mikrotubulu-multzoen asimetria eta ezkerreko edo eskuineko hazkundea eragiten dute Arabidopsis 6,7-n. Era berean, mikrotubulu-dinamika erregulatzen duten mikrotubuluekin lotutako proteinen mutazioek sustraien hazkunde desitxuratua ere eragin dezakete8,9,10,11,12,13. Horrez gain, mikrotubuluak asaldatzen dituzten herbizidekin, hala nola disopiramidarekin (pretilaklor izenez ere ezaguna), egindako tratamenduak ere ezkerreko zeiharkako sustraien hazkundea eragiten du14. Datu hauek adierazten dute mikrotubulu-funtzioaren erregulazio zehatza ezinbestekoa dela landareen hazkundearen norabidea zehazteko.
Mikrotubulu inhibitzaile mota desberdinak aurkitu dira, eta sendagai hauek ekarpen handiak egin dituzte zitoeskeletoaren ikerketan, baita nekazaritzan eta medikuntzan ere2. Bereziki, orizalinak, dinitroanilina konposatuek, disopiramidek, bentzamidarekin erlazionatutako konposatuek eta haien analogoek mikrotubulu-funtzioa inhibitu dezakete eta, beraz, landareen hazkuntza inhibitu. Hori dela eta, herbizida gisa asko erabiltzen dira. Hala ere, mikrotubuluak landare- eta animalia-zelulen osagai garrantzitsua direnez, mikrotubulu inhibitzaile gehienak zitotoxikoak dira bi zelula motentzat. Beraz, herbizida gisa duten erabilgarritasuna aitortuta egon arren, antimikrotubulu agente kopuru mugatu bat erabiltzen da helburu praktikoetarako.
Streptomyces Streptomyces familiako genero bat da, bakterio aerobiko, gram-positibo eta filamentosoak barne hartzen dituena, eta metabolito sekundario ugari sortzeko duen gaitasunagatik ezaguna da. Hori dela eta, produktu natural biologikoki aktibo berrien iturri garrantzitsuenetakotzat hartzen da. Oraingo ikerketan, kumamonamida izeneko konposatu berri bat aurkitu dugu, Streptomyces werraensis MK493-CF1 eta S. werraensis ISP 5486-tik isolatua. Analisi espektral eta analisi espektral osoa erabiliz, kumamonamidaren egitura karakterizatu da eta bere N-alkoxipirrol eskeleto berezia zehaztu da. sintesia. Ursmonoamidaren eta bere deribatuen bitartekari sintetikoa den azido ursonikoak Arabidopsis thaliana landare eredu ezagunaren hazkuntza eta ernetzea inhibitzen duela ikusi da. Egitura-jarduera erlazioaren ikerketa batean, ikusi dugu C9 azido ursonikora aldatutako konposatu batek, azido ursonikoaren noniloxi deribatua (KAND) izenekoak, hazkuntzan eta ernetzean duen efektu inhibitzailea nabarmen hobetzen duela. Azpimarratzekoa da landareen hazkuntza-inhibitzaile berriak tabakoaren eta gibel-belarren hazkuntzan ere eragina izan zuela eta ez zela zitotoxikoa bakterioentzat edo HeLa zelulentzat. Gainera, azido urmotonikoaren deribatu batzuek sustraien fenotipo desitxuratua eragiten dute, eta horrek esan nahi du deribatu hauek zuzenean edo zeharka eragiten dietela mikrotubuluei. Ideia honekin bat etorriz, immunohistomikoki edo proteina fluoreszenteekin markatutako mikrotubuluen gure behaketek adierazten dute KAND tratamenduak mikrotubuluak despolimerizatzen dituela. Horrez gain, azido kumamotonikoaren deribatuekin egindako tratamenduak aktina mikrofilamenduak eten zituen. Horrela, landareen hazkuntza-inhibitzaile berri bat aurkitu dugu, zeinaren ekintza-mekanismo berezia zitoeskeletoa suntsitzea dakarren.
MK493-CF1 anduia lurzorutik isolatu zen Shinagawa-ku-n, Tokion. MK493-CF1 anduiak estroma-mizelio ondo adarkatua eratu zuen. 16S erribosoma-RNA genearen sekuentzia partziala (1422 bp) zehaztu zen. Andui hau S. werraensis-en oso antzekoa da (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: andui tipikoa, % 99,93). Emaitza honetan oinarrituta, zehaztu zen andui hau S. werraensis-en andui motarekin oso lotuta zegoela. Hori dela eta, behin-behinekoz S. werraensis MK493-CF1 izena eman genion andui honi. S. werraensis ISP 5486T-k ere konposatu bioaktibo berdinak ekoizten ditu. Mikroorganismo honetatik produktu naturalak lortzeko hasierako ikerketa gutxi egin zirenez, ikerketa kimiko gehiago egin ziren. S. werraensis MK493-CF1 garagar-ingurune batean 30 °C-tan hartzidura solidoaren bidez 14 egunez landu ondoren, ingurunea % 50 EtOH-rekin erauzi zen. 60 ml lagin lehortu ziren 59,5 mg erauzkin gordin lortzeko. Erazkin gordina alderantzizko faseko HPLC bidez jasan zen N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamida (1, kumamonamida izendatua, 36,0 mg) emateko. 1-en kantitate osoa erauzkin gordinaren % 60 inguru da. Hori dela eta, kumamotoamida 1-en propietateak xehetasunez aztertzea erabaki genuen.
Coumamonamida 1 hauts amorfo zuri bat da eta bereizmen handiko masa-espektrometriak (HRESIMS) C6H8N2O2 baieztatzen du (1. irudia). Konposatu honen C2-ordezkatutako pirrol zatia δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR espektroan: 4.5 Hz, H-5) eta δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) espektroek ezaugarritzen dute, eta 13C NMR espektroak lau sp2 karbono atomoren presentzia erakusten du. C2 posizioan amida talde baten presentzia HMBC korrelazioaren bidez ebaluatu zen C-3 protoitik amida karbonilo karbonoraino δC 161.1-tan. Gainera, δH 4.10 (3H, S) eta δC 68.3-tan dauden 1 H eta 13 C NMR gailurrek molekulan N-metoxi taldeen presentzia adierazten dute. Metoxi taldearen posizio zuzena oraindik ez da zehaztu analisi espektroskopikoa erabiliz, hala nola diferentzia hobetuaren espektroskopia eta Overhauser nuklearraren laburdura (NOEDF), baina N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamida izan zen lehen konposatu hautagai.
1-en egitura zuzena zehazteko, sintesi osoa egin zen (2a irudia). Merkataritza-eskuragarri dagoen 2-aminopiridina 2 m-CPBArekin tratatzeak dagokion N-oxidoa 3 eman zuen etekin kuantitatiboan. 2-ren 2-aminoazidazioaren ondoren, Abramovich-ek deskribatutako ziklokondentsazio erreakzioa bentzenoan egin zen 90 °C-tan, nahi zen 1-hidroxi-1H-pirrol-2-karbonitrilo 5 gramotan lortzeko. Abiadura % 60 (bi etapa). 15,16. Ondoren, 4-ren metilazioa eta hidrolisiak 1-metoxi-1H-pirrol-2-karboxiliko azidoa ("azido kumotonikoa" deiturikoa, 6) eman zuen etekin onean (% 70, bi etapa). Azkenik, amoniako urtsua erabiliz azido kloruro bitarteko 6 bidezko amidazioak Kumamoto amida 1 eman zuen % 98ko etekinean. Sintetizatutako 1-en datu espektral guztiak 1 isolatuaren antzekoak ziren, beraz, 1-en egitura zehaztu zen;
Urbenamidaren eta azido urbenikoaren jarduera biologikoaren sintesi orokorra eta analisia. (a) Kumamoto amiden sintesi osoa. (b) Zazpi eguneko Arabidopsis Columbia (Col) landareak Murashige eta Skoog (MS) plaketan hazi ziren, adierazitako kontzentrazioetan kumamonamida 6 edo kumamonamida 1 zituztenak. Eskala barra = 1 cm.
Lehenik eta behin, urbenamidaren eta bere bitartekarien jarduera biologikoak ebaluatu genituen landareen hazkuntza modulatzeko duten gaitasuna ikusteko. Ursmonamida 1 edo azido ursoniko 6 kontzentrazio desberdinak gehitu genituen MS agar medioari eta Arabidopsis thaliana landareak landu genituen medio horretan. Saiakuntza hauek erakutsi zuten 6-ren kontzentrazio altuek (500 μM) sustraien hazkuntza inhibitzen zutela (2b irudia). Ondoren, hainbat deribatu sortu genituen 6-ren N1 posizioa ordezkatuz eta egitura-jarduera erlazioaren azterketak egin genituen (sintesi analogikoaren prozesua Informazio Osagarrian (SI) deskribatzen da). Arabidopsis landareak 50 μM azido ursoniko deribatuak zituen medio batean hazi ziren, eta sustraien luzera neurtu zen, irudian erakusten den bezala. 3a, b eta S1 irudietan erakusten den bezala, kumamo azidoek alkoxi kate linealen luzera desberdinak dituzte (9, 10, 11, 12 eta 13) edo alkoxi kate handiak (15, 16 eta 17) N1 posizioan. Deribatuek sustraien hazkuntzaren inhibizio nabarmena erakutsi zuten. Gainera, ikusi genuen 200 μM-ko 10, 11 edo 17 aplikazioak ernetzea inhibitzen zuela (3c eta S2 irudiak).
Kumamoto amidaren eta antzeko konposatuen egitura-jarduera erlazioaren azterketa. (a) Analogoen egitura eta sintesi eskema. (b) MS ingurunean hazitako 7 eguneko plantulen sustraien luzeraren kuantifikazioa, 50 μM-ko kumamonamida deribatuekin edo gabe. Asteriskoek tratamendu faltsuarekiko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (t testa, p< 0,05). n>18. Datuak batez besteko ± SD gisa erakusten dira. nt-k "ez da probatu" esan nahi du, hazien % 50 baino gehiago ez baitira ernetu. (c) MS ingurunean 7 egunez inkubatu diren tratatutako hazien ernetze-tasaren kuantifikazioa, 200 μM-ko kumamonamida eta antzeko konposatuekin edo gabe. Asteriskoek tratamendu faltsuarekiko (khi-karratu testa) desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte. n=96.
Interesgarria da, C9 baino luzeagoak diren alkilo albo-kateen gehiketak inhibizio-jarduera murriztu zuela, eta horrek iradokitzen du azido kumamotoikoarekin erlazionatutako konposatuek tamaina jakin bateko albo-kateak behar dituztela beren jarduera biologikoa erakusteko.
Egitura-jarduera erlazioaren analisiak erakutsi zuenez C9 azido ursonikora aldatuta zegoela eta azido ursonikoaren noniloxi deribatua (aurrerantzean KAND 11) landareen hazkuntza inhibitzaile eraginkorrena zela, KAND 11ren karakterizazio zehatzagoa egin genuen. Arabidopsis 50 μM KAND 11rekin tratatzeak ia erabat eragotzi zuen ernetzea, KAND 11 kontzentrazio txikiagoek (40, 30, 20 edo 10 μM) sustraien hazkuntza inhibitzen zuten bitartean dosiaren araberako moduan (4a, b irudiak). KAND 11k sustraien meristemoaren bideragarritasunari eragiten dion ala ez probatzeko, propidio ioduroarekin (PI) tindatutako sustraien meristemoak aztertu genituen eta meristemoaren azaleraren tamaina neurtu genuen. 25 μM KAND-11 zuen ingurune batean hazitako landareen meristemoaren tamaina 151,1 ± 32,5 μm-koa izan zen, eta DMSO zuen kontrol-ingurune batean hazitako landareen meristemoaren tamaina, berriz, 264,7 ± 30,8 μm-koa izan zen (4c eta d irudiak), eta horrek adierazten du KAND-11ek zelulen jarduera berreskuratzen duela. hedapena. Erroaren meristemoa. Honekin bat etorriz, KAND 11 tratamenduak CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS zelula-zatiketa markatzailearen seinalearen kopurua murriztu zuen erroaren meristemoan (4e irudia) 17. Emaitza hauek adierazten dute KAND 11ek sustraien hazkundea inhibitzen duela zelulen ugalketa-jarduera murriztuz.
Urbenon azidoaren deribatuen (urbeniloxi deribatuak) hazkuntzan duten efektu inhibitzailearen azterketa. (a) 7 eguneko Col motako landareak, adierazitako KAND 11 kontzentrazioekin MS plaketan hazitakoak. Eskala barra = 1 cm. (b) Sustraien luzeraren kuantifikazioa. Letrek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Tukey HSD testa, p< 0,05). n>16. Datuak batez besteko ± SD gisa erakusten dira. (c) MS plaketan hazitako propidio ioduroz tindatutako Col motako sustraien mikroskopia konfokala, 25 μM KAND 11-rekin edo gabe. Parentesi zuriek erro meristemoa adierazten dute. Eskala barra = 100 µm. (d) Erro meristemoaren tamainaren kuantifikazioa (n = 10etik 11ra). Desberdintasun estatistikoak t-testa erabiliz zehaztu ziren (p< 0,05). Barrek meristemoaren batez besteko tamaina adierazten dute. (e) CDKB2 konstruktua duen erro meristemo baten interferentzia-kontraste diferentzialaren (DIC) mikroskopia; 1pro: CDKB2; 1-GUS tindatua eta MS plaketan hazitako 5 eguneko plantuletan tindatua, 25 µM KAND analisiarekin edo gabe.
KAND 11-ren fitotoxikotasuna beste landare dikotiledoneo bat erabiliz aztertu zen, tabakoa (Nicotiana tabacum), eta lurreko landare eredu-organismo nagusi bat, gibel-belarra (Marchantia polymorpha). Arabidopsis-en kasuan bezala, 25 μM KAND 11 zuen ingurunean hazitako tabako SR-1 landareek sustrai laburragoak sortu zituzten (5a irudia). Gainera, 48 hazietatik 40 200 μM KAND 11 zuten plaketan ernetu ziren, eta 48 hazi guztiak, berriz, tratatutako inguruneetan ernetu ziren, eta horrek adierazten du KAND kontzentrazio altuagoak esanguratsuak zirela (p< 0,05; khi testa -karratua) tabakoaren ernetzea inhibitzen zuen. (5b irudia). Gainera, gibel-belarretan bakterioen hazkundea inhibitzen zuen KAND 11 kontzentrazioa Arabidopsis-en kontzentrazio eraginkorraren antzekoa zen (5c irudia). Emaitza hauek adierazten dute KAND 11-k landare askoren hazkundea inhibitzen dezakeela. Ondoren, hartz monoamidarekin erlazionatutako konposatuen zitotoxikotasun posiblea ikertu genuen beste organismo batzuetan, hots, gizakien HeLa zeluletan eta Escherichia coli DH5α anduian, animalia- eta bakterio-zelulen ordezkari gisa, hurrenez hurren. Zelulen ugalketa-analisi sorta batean, ikusi genuen kumamonamida 1-ek, kumamonamidiko azido 6-k eta KAND 11-k ez zutela eraginik HeLa edo E. coli zelulen hazkundean 100 μM-ko kontzentrazioetan (5d eta e irudiak).
KAND 11ren hazkuntza inhibitzea Arabidopsis ez diren organismoetan. (a) Bi asteko SR-1 tabako landareak 25 μM KAND 11 zuten MS plaka bertikaletan hazi ziren. (b) Bi asteko SR-1 tabako landareak 200 μM KAND 11 zuten MS plaka horizontaletan hazi ziren. (c) Bi asteko Tak-1 gibel-belar kimuak Gamborg B5 plaketan hazi ziren, adierazitako KAND 11 kontzentrazioekin. Gezi gorriek bi asteko inkubazio-aldian hazteari utzi dioten esporak adierazten dituzte. (d) HeLa zelulen zelulen ugalketa-analisia. Zelula bideragarrien kopurua denbora-tarte finkoetan neurtu zen, zelulak zenbatzeko kit 8 bat erabiliz (Dojindo). Kontrol gisa, HeLa zelulak 5 μg/ml aktinomizina D-rekin (Act D) tratatu ziren, eta horrek RNA polimerasaren transkripzioa inhibitzen du eta zelulen heriotza eragiten du. Analisiak hirukoiztuta egin ziren. (e) E. coli zelulen ugalketa-analisia. E. coli hazkuntza OD600 neurtuz aztertu zen. Kontrol gisa, zelulak 50 μg/ml ampizilinarekin (Amp) tratatu ziren, eta horrek bakterioen zelula-hormaren sintesia inhibitzen du. Analisiak hirukoiztuta egin ziren.
Uramidoekin lotutako konposatuek eragindako zitotoxikotasunaren ekintza-mekanismoa deszifratzeko, efektu inhibitzaile moderatuak dituzten azido urbenikoaren deribatuak berriro aztertu genituen, irudian ikusten den bezala. 2b eta 6a irudietan ikusten den bezala, azido urmotoniko 6 kontzentrazio altuak (200 μM) zituzten agar plaketan hazitako landareek sustrai laburragoak eta ezkerretara kurbatuak sortu zituzten (θ = – 23,7 ± 6,1), eta kontrol-ingurunean hazitako landareek, berriz, sustrai ia zuzenak sortu zituzten (θ = – 3,8 ± 7,1). Hazkunde zeihar karakteristiko hau kortexeko mikrotubuluen disfuntzioaren ondorioz gertatzen dela ezagutzen da14,18. Aurkikuntza honekin bat etorriz, mikrotubuluak desestabilizatzen dituzten disopiramida eta orizalina drogek sustraien okertze antzekoa eragin zuten gure hazkuntza-baldintzetan (2b eta 6a irudiak). Aldi berean, azido urmotonikoaren deribatuak probatu genituen eta horietako batzuk hautatu genituen, kontzentrazio jakin batzuetan, sustraien hazkunde zeiharra eragiten zutenak. 8, 9 eta 15 konposatuek sustraien hazkuntzaren norabidea aldatu zuten 75 μM, 50 μM eta 40 μM-tan, hurrenez hurren, eta horrek adierazten du konposatu hauek mikrotubuluak eraginkortasunez desestabiliza ditzaketela (2b eta 6a irudiak). Azido ursolikoaren deribatu indartsuena ere probatu genuen, KAND 11, kontzentrazio baxuagoan (15 µM) eta ikusi genuen KAND 11 aplikazioak sustraien hazkuntza inhibitzen zuela eta sustraien hazkuntzaren norabidea irregularra zela, nahiz eta ezkerretara okertzeko joera izan (C3 irudia). Mikrotubuluak desestabilizatzen dituzten drogen kontzentrazio handiagoek batzuetan landareen hazkuntza inhibitzen dutenez, sustraien okerdura eragin beharrean, ondoren ebaluatu genuen KAND 11k mikrotubuluei eragiten dien aukera, sustraien epidermis-zeluletan kortexeko mikrotubuluak behatuz. 25 μM-ko KAND 11rekin tratatutako plantulen sustraien epidermis-zeluletan anti-β-tubulina antigorputzak erabiliz egindako immunohistokimikak luzapen-eremuko epidermis-zeluletan ia kortexeko mikrotubulu guztiak desagertzen zirela erakutsi zuen (6b irudia). Emaitza hauek adierazten dute azido kumamotonikak eta bere deribatuak zuzenean edo zeharka mikrotubuluetan eragiten dutela haiek eteteko eta konposatu hauek mikrotubulu inhibitzaile berriak direla.
Azido ursonikoak eta bere deribatuek Arabidopsis thaliana-n kortexeko mikrotubuluak aldatzen dituzte. (a) Sustraien inklinazio angelua hainbat azido urmotoniko deribatuen aurrean neurtua, adierazitako kontzentrazioetan. Mikrotubuluak inhibitzen dituztela ezagutzen diren bi konposaturen efektuak ere aztertu ziren: disopiramida eta orizalina. Txertatutako irudiak sustraien hazkuntza-angelua neurtzeko erabilitako estandarra erakusten du. Asteriskoek tratamendu faltsuarekiko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (t testa, p< 0,05). n>19. Eskala-barra = 1 cm. (b) Luzapen-eremuko zelula epidermikoetako kortex-mikrotubuluak. MS plaketan hazitako Arabidopsis Col sustrai basatietako mikrotubuluak, 25 μM KAND 11rekin edo gabe, immunohistokimiko tindaketaren bidez ikusi ziren, β-tubulina lehen mailako antigorputzak eta Alexa Fluor-konjugatutako bigarren mailako antigorputzak erabiliz. Eskala-barra = 10 µm. (c) Erro meristemoko mikrotubuluen egitura mitotikoa. Mikrotubuluak immunohistokimiko tindaketaren bidez ikusi ziren. Egitura mitotikoak, profase-eremuak, ardatzak eta fragmoplastoak barne, irudi konfokaletatik zenbatu ziren. Geziek mikrotubulu mitotikoen egiturak adierazten dituzte. Izartxoek tratamendu faltsuarekiko desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (t testa, p< 0,05). n>9. Eskala-barra = 50 µm.
Ursak mikrotubuluen funtzioa eteteko gaitasuna badu ere, bere ekintza-mekanismoa mikrotubuluen despolimerizazio-agente tipikoetatik desberdina izatea espero da. Adibidez, mikrotubuluen despolimerizazio-agenteen kontzentrazio handiagoek, hala nola disopiramidak eta orizalinak, zelula epidermikoen hedapen anisotropikoa eragiten dute, KAND 11k, berriz, ez. Gainera, KAND 11 eta disopiramida batera aplikatzeak disopiramidak eragindako sustraien hazkuntza-erantzun konbinatua eragin zuen eta KAND 11k eragindako hazkuntza-inhibizioa ikusi zen (S4 irudia). Disopiramida 1-1 (phs1-1) mutante hipersentikorraren KAND 11rekiko erantzuna ere aztertu genuen. phs1-1k tubulina kinasa puntuko mutazio ez-kanonikoa du eta sustrai laburragoak sortzen ditu disopiramidarekin tratatzen denean9,20. KAND 11 duen agar-ingurunean hazitako phs1-1 mutante-landareek disopiramidan hazitakoen antzeko sustrai laburragoak zituzten (S5 irudia).
Horrez gain, KAND 11-rekin tratatutako plantulen sustrai meristemoan mikrotubulu mitotikoen egiturak ikusi genituen, hala nola profase-zonak, ardatzak eta fragmoplastoak. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-en behaketekin bat etorriz, mikrotubulu mitotikoen kopuruan beherakada nabarmena ikusi zen (6c irudia).
KAND 11-ren zitotoxikotasuna bereizmen subzelularrean karakterizatzeko, tabako BY-2 esekidura-zelulak KAND 11-rekin tratatu genituen eta haien erantzuna ikusi genuen. Lehenik eta behin, KAND 11 gehitu genien TagRFP-TUA6 adierazten duten BY-2 zelulei, mikrotubuluak fluoreszenteki markatzen dituena, KAND 11-k kortexeko mikrotubuluetan duen eragina ebaluatzeko. Kortexeko mikrotubulu-dentsitatea irudi-analisi bidez ebaluatu zen, zitoplasmako pixelen artean zitoeskeletoko pixelen ehunekoa kuantifikatuz. Saiakuntzaren emaitzek erakutsi zuten 50 μM edo 100 μM KAND 11-rekin ordubetez tratatu ondoren, dentsitatea nabarmen jaitsi zela % 0,94 ± 0,74ra edo % 0,23 ± 0,28ra, hurrenez hurren, DMSO-rekin tratatutako zelulen dentsitatea % 1,61 ± 0,34ra iritsi zela (7a irudia). Emaitza hauek Arabidopsis-en egindako behaketarekin bat datoz, KAND 11 tratamenduak kortexeko mikrotubulu-despolimerizazioa eragiten duela (6b irudia). KAND 11 kontzentrazio berdinarekin tratatu ondoren, GFP-ABD markatutako aktina-harizpiekin BY-2 lerroa ere aztertu genuen, eta ikusi genuen KAND 11 tratamenduak aktina-harizpiak eten zituela. 50 μM edo 100 μM KAND 11rekin ordubetez tratatzeak aktina-harizpien dentsitatea % 1,20 ± 0,62ra edo % 0,61 ± 0,26ra murriztu zuen nabarmen, hurrenez hurren, DMSOrekin tratatutako zelulen dentsitatea % 1,69 ± 0,51ekoa izan zen bitartean (2. irudia). 7b). Emaitza hauek kontrastatzen dute propizamidaren efektuekin, zeinak ez baitu aktina-harizpietan eragiten, eta latrunkulina B-ren efektuekin, mikrotubuluetan eragiten ez duen aktina-despolimerizatzaile batekin (SI S6 irudia). Gainera, kumamonamida 1, kumamonamida azido 6 edo KAND 11rekin tratatzeak ez zuen HeLa zeluletako mikrotubuluetan eraginik izan (SI S7 irudia). Beraz, uste da KAND 11-ren ekintza-mekanismoa zitoeskeleto-nahasle ezagunen ekintza-mekanismotik desberdina dela. Gainera, KAND 11-rekin tratatutako BY-2 zelulen gure behaketa mikroskopikoak zelulen heriotzaren hasiera agerian utzi zuen KAND 11 tratamenduan zehar eta erakutsi zuen Evans urdinez tindatutako zelula hilen proportzioa ez zela nabarmen handitu KAND 11 tratamenduaren 30 minutu igaro ondoren, aldiz, 50 μM edo 100 μM KAND-rekin 90 minutu igaro ondoren, zelula hilen kopurua % 43,7ra edo % 80,1era igo zen, hurrenez hurren (7c irudia). Datu hauek guztiak kontuan hartuta, KAND 11 azido ursolikoaren deribatu berria landare-espezifiko zitoeskeletoaren inhibitzaile bat dela, aurretik ezezaguna zen ekintza-mekanismo batekin.
KAND-ek kortexeko mikrotubuluetan, aktinazko filamentuetan eta tabako BY-2 zelulen bideragarritasunean eragiten du. (a) BY-2 zeluletako kortexeko mikrotubuluen bistaratzea TagRFP-TUA6-ren aurrean. KAND 11-rekin (50 μM edo 100 μM) edo DMSO-rekin tratatutako BY-2 zelulak mikroskopia konfokal bidez aztertu ziren. Kortexeko mikrotubulu-dentsitatea 25 zelula independenteren mikrografietatik kalkulatu zen. Letrek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Tukey HSD testa, p< 0,05). Eskala-barra = 10 µm. (b) GFP-ABD2-ren aurrean bistaratutako BY-2 zeluletako kortex-aktinazko harizpiak. KAND 11-rekin (50 μM edo 100 μM) edo DMSO-rekin tratatutako BY-2 zelulak mikroskopia konfokal bidez aztertu ziren. Kortex-aktinazko harizpien dentsitatea 25 zelula independenteren mikrografietatik kalkulatu zen. Letrek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Tukey HSD testa, p< 0,05). Eskala-barra = 10 µm. (c) BY-2 zelula hilen behaketa Evans urdin tindaketaren bidez. KAND 11 (50 μM edo 100 μM) edo DMSOrekin tratatutako BY-2 zelulak eremu argiko mikroskopia bidez aztertu ziren. n=3. Eskala-barra = 100 µm.
Produktu natural berrien aurkikuntzak eta aplikazioak aurrerapen nabarmenak ekarri ditu giza bizitzaren hainbat alderditan, besteak beste, medikuntzan eta nekazaritzan. Ikerketa historikoak egin dira konposatu erabilgarriak baliabide naturaletatik lortzeko. Bereziki, aktinomizetoak nematodoentzako antiparasitario antibiotiko gisa erabilgarriak direla ezagutzen da, bigarren mailako metabolito ugari sortzeko duten gaitasunagatik, hala nola avermektina, ivermektinaren konposatu nagusia eta bleomizina eta bere deribatuak, minbiziaren aurkako agente gisa erabiltzen direnak medikuntzan21,22. Era berean, hainbat konposatu herbizida aurkitu dira aktinomizetoetatik, eta horietako batzuk dagoeneko komertzialki erabiltzen dira1,23. Beraz, aktinomizetoen metabolitoen analisia estrategia eraginkortzat hartzen da, nahi diren jarduera biologikoak dituzten produktu naturalak isolatzeko. Ikerketa honetan, S. werraensis-etik datorren konposatu berri bat aurkitu dugu, kumamonamida, eta arrakastaz sintetizatu dugu. Azido ursonikoa urbenamidaren eta bere deribatuen bitartekari sintetikoa da. Sustraien kizkurdura bereizgarria eragin dezake, jarduera herbizida moderatua edo handia izan dezake, eta zuzenean edo zeharka landareen mikrotubuluak kaltetu ditzake. Hala ere, azido urmotonikoaren ekintza-mekanismoa mikrotubulu-inhibitzaileen ekintzatik desberdina izan daiteke, KAND 11-k aktina-harizpiak ere eten eta zelulen heriotza eragiten baitu, eta horrek iradokitzen du azido urmotonikoak eta bere deribatuek zitoeskeletoko egitura ugari eragiten dituzten erregulazio-mekanismo bat dagoela.
Urbenoiko azidoaren karakterizazio zehatzagoak azido urbenoikoaren ekintza-mekanismoa hobeto ulertzen lagunduko du. Bereziki, hurrengo helburua azido ursonikoak mikrotubulu murriztuei lotzeko duen gaitasuna ebaluatzea da, azido ursonikoak eta bere deribatuek zuzenean eragiten dieten mikrotubuluetan eta despolimerizatzen dituzten ala haien ekintzak mikrotubuluen desestabilizazioa eragiten duen zehazteko. Gainera, mikrotubuluak ez diren helburu zuzena kasuan, azido ursonikoaren ekintza-gunea eta helburu molekularrak landare-zeluletan identifikatzeak konposatu erlazionatuen propietateak eta herbizida-jarduera hobetzeko modu posibleak hobeto ulertzen lagunduko du. Gure bioaktibitate-analisiak azido ursonikoak Arabidopsis thaliana, tabakoa eta gibel-belarra bezalako landareen hazkuntzan duen gaitasun zitoxiko berezia agerian utzi zuen, ez E. coli ez HeLa zelulak ez ziren bitartean eragin. Animalia-zelulen aurkako toxikotasun gutxi edo batere ez izatea azido ursonikoko deribatuen abantaila bat da, nekazaritza-eremu irekietan erabiltzeko herbizida gisa garatzen badira. Izan ere, mikrotubuluak eukariotoetan ohikoak diren egiturak direnez, landareetan duten inhibizio selektiboa herbiziden funtsezko baldintza da. Adibidez, propizamida, tubulinari zuzenean lotzen zaion eta polimerizazioa inhibitzen duen mikrotubuluen despolimerizatzaile bat, herbizida gisa erabiltzen da animalia-zeluletan duen toxikotasun txikia dela eta24. Disopiramidaren aldean, antzeko bentzamidek helburu-espezifikotasun desberdinak dituzte. Landare-mikrotubuluez gain, RH-4032 edo bentzoxamidak animalia-zelulen edo oomizetoen mikrotubuluak ere inhibitzen dituzte, hurrenez hurren, eta zalilamida fungizida gisa erabiltzen da bere fitotoxikotasun txikia dela eta25,26,27. Hartz berri aurkituak eta bere deribatuek zitotoxikotasun selektiboa erakusten dute landareen aurka, baina kontuan izan behar da aldaketa gehiagok haien helburu-espezifikotasuna alda dezaketela, onddo patogenoak edo oomizetoak kontrolatzeko deribatu gehigarriak emanez.
Urbenoiko azidoaren eta haren deribatuen propietate bereziak baliagarriak dira herbizida gisa garatzeko eta ikerketa-tresna gisa erabiltzeko. Zitoeskeletoaren garrantzia landare-zelulen forma kontrolatzeko oso ezaguna da. Aurreko ikerketek erakutsi dute landareek kortexeko mikrotubuluen antolakuntzarako mekanismo konplexuak garatu dituztela, mikrotubuluen dinamika kontrolatuz morfogenesia behar bezala kontrolatzeko. Mikrotubuluen jarduera erregulatzeaz arduratzen diren molekula ugari identifikatu dira, eta horri buruzko ikerketak oraindik martxan daude3,4,28. Landare-zelulen mikrotubuluen dinamikari buruzko gure egungo ulermenak ez ditu guztiz azaltzen kortexeko mikrotubuluen antolakuntzaren mekanismoak. Adibidez, bai disopiramidak bai orizalinak mikrotubuluak despolimerizatu ditzaketen arren, disopiramidak sustraien distortsio larria eragiten du, orizalinak, berriz, efektu nahiko arina du. Gainera, mikrotubuluak egonkortzen dituen tubulinaren mutazioek dextrorrotazioa ere eragiten dute sustraietan, eta paklitaxelak, mikrotubuluen dinamika ere egonkortzen duenak, ez. Beraz, azido ursolikoaren helburu molekularrak aztertzeak eta identifikatzeak ikuspegi berriak eman beharko lituzke landareen kortexeko mikrotubuluen erregulazioari buruz. Era berean, hazkunde desitxuratua sustatzeko eraginkorrak diren produktu kimikoen, hala nola disopiramida, eta eraginkortasun gutxiago duten produktu kimikoen, hala nola orizalina edo azido kumamotorikoa, etorkizunean egindako konparaketek hazkunde desitxuratua nola gertatzen den jakiteko pistak emango dituzte.
Bestalde, defentsa-erlazionatutako zitoeskeletoaren berrantolaketak beste aukera bat dira azido ursonikoaren zitotoxikotasuna azaltzeko. Patogeno baten infekzioak edo landare-zeluletan elizle bat sartzeak batzuetan zitoeskeletoaren suntsipena eta ondorengo zelulen heriotza eragiten ditu29. Adibidez, oomizetoetatik eratorritako kriptoxantina-k mikrotubuluak eta aktina-harizpiak eten egiten dituela jakinarazi da tabako-zelulen heriotzaren aurretik, KAND tratamenduarekin gertatzen den antzera30,31. Azido ursonikoak eragindako defentsa-erantzunen eta zelulen erantzunen arteko antzekotasunek hipotesi batera eraman gaituzte prozesu zelular komunak abiarazten dituztela, nahiz eta azido ursonikoaren efektu azkarragoa eta indartsuagoa dela kriptoxantina baino agerikoa den. Hala ere, ikerketek erakutsi dute aktina-harizpien hausturak zelulen heriotza espontaneoa sustatzen duela, eta hori ez dela beti mikrotubuluen hausturarekin batera doala29. Gainera, ikusi behar da patogenoak edo elizleak sustraien hazkuntza desitxuratua eragiten duen, azido ursonikoaren deribatuek bezala. Beraz, defentsa-erantzunak eta zitoeskeletoa lotzen dituen ezagutza molekularra jorratu beharreko arazo erakargarria da. Azido ursonikoarekin erlazionatutako pisu molekular baxuko konposatuen presentzia eta potentzia desberdineko deribatu sorta bat aprobetxatuz, zelula-mekanismo ezezagunak helburu hartzeko aukerak eman ditzakete.
Oro har, mikrotubulu-dinamika modulatzen duten konposatu berrien aurkikuntzak eta aplikazioak metodo indartsuak eskainiko ditu landare-zelulen formaren zehaztapenaren oinarrian dauden mekanismo molekular konplexuak jorratzeko. Testuinguru honetan, duela gutxi garatu den azido urmotonikoa den konposatuak, mikrotubuluei eta aktina-harizpiei eragiten diena eta zelulen heriotza eragiten duena, aukera eman dezake mikrotubulu-kontrolaren eta beste mekanismo horien arteko lotura deszifratzeko. Horrela, azido urbenonikoa erabiliz egindako analisi kimiko eta biologikoak landare-zitoeskeletoa kontrolatzen duten erregulazio-mekanismo molekularrak ulertzen lagunduko digu.
Txertatu S. werraensis MK493-CF1 500 ml-ko Erlenmeyer matraze batean, 110 ml hazi-ingurunearekin, honako hauek osatua: % 2 (p/v) galaktosa, % 2 (p/v) Essence pasta, % 1 (p/v) Bacto konposizioa. -sojona (Thermo Fisher Scientific, Inc.), % 0,5 (p/v) arto-estraktua (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), % 0,2 (p/v) (NH4)2SO4 eta % 0,2 (pH 7,4 esterilizazioaren aurretik). Hazi-kulturak astindugailu birakari batean inkubatu ziren (180 rpm) 27 °C-tan 2 egunez. Ekoizpen-kultura hartzidura solidoaren bidez. Hazi-kultura (7 ml) 500 ml-ko K-1 matraze batera eraman zen, eta bertan 40 g ekoizpen-ingurune zeuden, 15 g garagar prentsatu (MUSO Co., Ltd., Japonia) eta 25 g ur desionizatuz osatua (pH-a ez da esterilizatu aurretik doitu). Hartzidura 30 °C-tan egin zen iluntasunean 14 egunez. Hartzidura-materiala 40 ml/botila EtOH-rekin erauzi eta zentrifugatu egin zen (1500 g, 4 °C, 10 min). Kultura-gainnatzailea (60 ml) % 10 MeOH/EtOAc nahasketa batekin erauzi zen. Geruza organikoa presio murriztuan lurrundu zen hondakin bat (59,5 mg) lortzeko, eta hau HPLC bidez gradiente eluzioarekin (0-10 minutu: % 90) jasan zen alderantzizko faseko zutabe batean (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × luzera 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minutu: % 90 H2O/CH3CN-tik % 70 H2O/CH3CN-ra (gradientea), 35-45 minutu: % 90 H2O/EtOH, 45-155 minutu: % 90 H2O/EtOH-tik % 100 EtOH-ra (gradientea (gradientea), 155-200 min: % 100 EtOH) 1,5 ml/min-ko emarian, kumamonamida (1, 36,0 mg) hauts zuri amorfo gisa isolatu zen.
Kumamotoamida(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkulatutako balioa: 141.0659, neurtutako balioa: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia haziak (Col-0) Arabidopsis Baliabide Biologikoen Zentrotik (ABRC) lortu ziren, ikerketarako erabiltzeko baimenarekin. Col-0 haziak gure laborategiko baldintzetan ugaldu eta mantendu ziren, eta Arabidopsis landare basati gisa erabili ziren. Arabidopsis haziak gainazalez esterilizatu eta Murashige eta Skoog erdi-kontzentrazioko medio batean landu ziren, % 2 sakarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), % 0,05 (p/v) 2-(4-morfolino)etanosulfoniko azidoa (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) eta % 1,5 agarra (Fujifilm Wako Pure Chemical) zituena, pH 5,7, 23 °C-tan eta argi konstantean. Phs1-1 mutantearen haziak T. Hashimotok eman zituen (Nara Zientzia eta Teknologia Institutua).
SR-1 anduiaren haziak T. Hashimotok eman zituen (Nara Zientzia eta Teknologia Institutua) eta tabako landare basati gisa erabili ziren. Tabako haziak gainazalean esterilizatu eta ur esterilean beratu ziren hiru gauz ernetzea sustatzeko, ondoren % 2 sakarosa, % 0,05 (p/v) MES eta % 0,8 gellan goma (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. eta Skoog medioa) zituen erdi-kontzentrazioko soluzio batean jarri ziren pH 5,7rekin eta 23 °C-tan inkubatu ziren argi etengabearen pean.
Tak-1 anduia T. Kohchik (Kiotoko Unibertsitatea) eman zuen eta gibel-belarren ikerketarako unitate esperimental estandar gisa erabili zen. Gemma landare esterilizatuetatik lortu zen eta ondoren Gamborg B5 ingurunean (Fujifilm Wako Pure Chemical) landatzen zen, % 1 sakarosa eta % 0,3 gellan goma zituena, eta 23 °C-tan inkubatu zen argi jarraituaren pean.
Tabako BY-2 zelulak (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa-k (Tokioko Unibertsitatea) eman zituen. BY-2 zelulak 95 aldiz diluitu ziren Linsmeier eta Skoog medio aldatuan eta astero osatu ziren 2,4-diklorofenoxiazetiko azidoarekin 32. Zelulen esekidura biraketa-astindugailu batean nahastu zen 130 bira/min-tan 27 °C-tan, iluntasunean. Garbitu zelulak medio freskoaren 10 aldiz bolumenarekin eta berriro eseki medio berean. AZALORE mosaiko birusaren 35S sustatzailearen azpian TagRFP-TUA6 mikrotubulu markatzailea edo GFP-ABD2 aktina harizpi markatzailea egonkor adierazten duten BY-2 zelula-lerro transgenikoak deskribatutako moduan sortu ziren33,34,35. Zelula-lerro hauek mantendu eta sinkronizatu daitezke jatorrizko BY-2 zelula-lerroarentzat erabilitakoen antzeko prozedurak erabiliz.
HeLa zelulak Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) batean landu ziren, % 10eko behi-fetuaren serumarekin, 1,2 U/ml penizilina eta 1,2 μg/ml estreptomizinaz osatuta, 37 °C-ko inkubagailu batean, % 5eko CO2-arekin.
Eskuizkribu honetan deskribatutako esperimentu guztiak Japoniako biosegurtasun araudi eta jarraibideen arabera egin ziren.
Konposatuak dimetil sulfoxidoan (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) disoluzio gisa disolbatu ziren eta MS medioan diluitu ziren Arabidopsis eta tabakoarentzat edo Gamborg B5 medioan gibel-belarrentzat. Sustraien hazkuntza inhibitzeko analisietarako, plaka bakoitzeko 10 hazi baino gehiago erein ziren adierazitako konposatuak edo DMSO zituen agar medioan. Haziak hazkuntza-ganbera batean inkubatu ziren 7 egunez. Landareei argazkiak atera zitzaizkien eta sustraien luzera neurtu zen. Arabidopsis ernetze-analisietarako, plaka bakoitzeko 48 hazi erein ziren 200 μM konposatu edo DMSO zuen agar medioan. Arabidopsis haziak hazkuntza-ganbera batean hazi ziren eta ernetutako landareen kopurua ernetu eta 7 egunera zenbatu zen (dag). Tabakoaren ernetze-analisietarako, plaka bakoitzeko 24 hazi erein ziren 200 μM KAND edo DMSO zuen agar medioan. Tabako haziak hazkuntza-ganbera batean hazi ziren eta ernetutako landareen kopurua 14 egun igaro ondoren zenbatu zen. Gibel-belarren hazkuntza inhibitzeko analisietarako, plaka bakoitzeko 9 enbrioi KAND edo DMSO kontzentrazio adieraziak zituen agar medioan landatu ziren eta hazkuntza-ganbera batean inkubatu ziren 14 egunez.
Erabili 5 mg/ml propidio ioduroarekin (PI) tindatutako plantulak erro meristemoaren antolaketa bistaratzeko. PI seinaleak fluoreszentzia mikroskopia bidez behatu ziren TCS SPE laser eskaneatze mikroskopio konfokal bat erabiliz (Leica Microsystems).
Sustraien tindaketa histokimikoa β-glukuronidasarekin (GUS) Malami eta Benfey-k36 deskribatutako protokoloaren arabera egin zen. Plantulak % 90eko azetonan finkatu ziren gau osoan, 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuroniko azidoarekin tindatu ziren GUS bufferrean ordubetez eta kloraldehido hidratatuaren disoluzio batean jarri ziren (8 g kloral hidrato, 2 ml ur eta 1 ml glizerol) eta interferentzia-kontraste mikroskopia diferentzial bidez behatu ziren Axio Imager M1 mikroskopio bat (Carl Zeiss) erabiliz.
Sustraien angeluak 7 eguneko plantulen neurketa egin zen, bertikalki jarritako plaketan hazitakoetan. Neurtu sustraiaren angelua grabitate bektorearen norabidearekiko, 6. urratsean deskribatutako moduan.
Kortexeko mikrotubuluen antolamendua deskribatutako moduan behatu zen, protokoloan aldaketa txikiekin 37. Anti-β-tubulina antigorputza (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) eta Alexa Fluor 488-konjugatutako anti-sagu IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) erabili ziren lehen eta bigarren mailako antigorputz gisa, 1:1000 eta 1:100 diluzioetan, hurrenez hurren. Fluoreszentzia irudiak TCS SPE laser eskaneatze mikroskopio konfokal bat erabiliz eskuratu ziren (Leica Microsystems). Eskuratu Z-stack irudiak eta sortu intentsitate maximoko proiekzioak fabrikatzailearen argibideen arabera.
HeLa zelulen ugalketaren analisia Cell Counting Kit 8 (Dojindo) erabiliz egin zen, fabrikatzailearen argibideen arabera.
E. coli DH5α-ren hazkuntza zelula-dentsitatea neurtuz aztertu zen, espektrofotometro bat erabiliz kulturan 600 nm-tan (OD600).
BY-2 zelula transgenikoen zitoeskeletoaren antolaketa CSU-X1 eskaneatze-gailu konfokal bat (Yokogawa) eta sCMOS kamera bat (Zyla, Andor Technology) dituen fluoreszentzia-mikroskopio bat erabiliz behatu zen. Zitoeskeletoaren dentsitatea irudi-analisi bidez ebaluatu zen, eta horrek zitoeskeletoko pixelen ehunekoa kuantifikatu zuen irudi konfokaletan zitoplasmako pixelen artean, ImageJ softwarea erabiliz, deskribatutako moduan38,39.
BY-2 zeluletan zelulen heriotza detektatzeko, zelula-suspentsioaren zati bat % 0,05eko Evans urdinarekin inkubatu zen 10 minutuz giro-tenperaturan. Zelula hilen Evans urdin tindaketa selektiboa zelula bideragarrietatik mintz plasmatiko osoak tindagaia estrusioan oinarritzen da40. Tindatutako zelulak eremu argiko mikroskopio bat erabiliz behatu ziren (BX53, Olympus).
HeLa zelulak % 10 FBS-rekin osaturiko DMEM-ean hazi ziren, 37 °C-tan eta % 5 CO2-tan hezetutako inkubagailu batean. Zelulak 100 μM KAND 11, azido kumamonamiko 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml kolzemid (Gibco) edo 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma)-rekin tratatu ziren 6 orduz 37 °C-tan. Zelulak MetOH-rekin finkatu ziren 10 minutuz eta gero azetatoarekin 5 minutuz giro-tenperaturan. Finkatutako zelulak β-tubulina antigorputz primarioarekin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) inkubatu ziren, % 0,5 BSA/PBS-tan diluituta 2 orduz, 3 aldiz garbitu ziren TBST-rekin, eta gero Alexa Fluor ahuntz antigorputzarekin inkubatu ziren. 488 1 orduz. – Sagu IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) eta 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) % 0,5 BSA/PBS-tan diluitua. Hiru aldiz TBSTrekin garbitu ondoren, zelula tindatuak Nikon Eclipse Ti-E mikroskopio alderantzikatu batean behatu ziren. Irudiak Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera hoztu batekin hartu ziren MetaMorph softwarea (Molecular Devices) erabiliz.
Argitaratze data: 2024ko ekainaren 17a