Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Emaitza onenak lortzeko, zure arakatzailearen bertsio berriagoa erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik edo JavaScript gabe erakusten ari gara.
Produktu naturalen aurkikuntza eta erabilera onuragarriak giza bizitza hobetzen lagun dezake.Landareen hazkuntza inhibitzeko produktu kimikoak oso erabiliak dira belar txarrak kontrolatzeko herbizida gisa.Herbizida mota desberdinak erabili beharra dela eta, ekintza mekanismo berriak dituzten konposatuak identifikatu beharra dago.Ikerketa honetan, Streptomyces werraensis MK493-CF1 N -alkoxipirrol konposatu berri bat aurkitu dugu, cumamonamida, eta sintesi prozesu osoa ezarri dugu.Jarduera biologikoaren saiakuntzen bidez, azido urs-monoamikoa urs-monoamidaren bitarteko sintetikoa eta potentzial bat dela aurkitu genuen.landareen hazkuntza inhibitzailea.Horrez gain, hainbat azido urbenoniko deribatu garatu ditugu, urbeniloxi deribatua (UDA) barne, jarduera herbizida handia duena, HeLa zelulen hazkuntzan eragin negatiborik gabe.Azido urmotonikoen deribatuek landareen mikrotubuluak apurtzen dituztela ere aurkitu dugu;gainera, KANDek aktina-harizpietan eragiten du eta zelulen heriotza eragiten du;Efektu anitzeko hauek mikrotubuluen inhibitzaile ezagunenetatik desberdinak dira eta azido ursonikoaren ekintza-mekanismo berri bat iradokitzen dute, eta horrek abantaila garrantzitsua suposatzen du herbizida berrien garapenean.
Produktu natural onuragarrien eta haien eratorrien aurkikuntza eta aplikazio praktikoa gizakiaren bizi-kalitatea hobetzeko bitarteko bat da.Mikroorganismoek, landareek eta intsektuek sortutako metabolito sekundarioek aurrerapen handiak ekarri dituzte medikuntzan eta nekazaritzan.Antibiotiko eta leuzemiaren aurkako sendagai asko produktu naturaletatik garatu dira.Horrez gain, hainbat motatakopestizidak, fungizidak eta herbizidak ateratzen dira produktu natural horietatik nekazaritzan erabiltzeko.Bereziki, belar txarrak kontrolatzeko herbizidak tresna garrantzitsuak dira laboreen errendimendua areagotzeko nekazaritza modernoan, eta dagoeneko hainbat konposatu mota erabiltzen dira komertzialki.Landareetako hainbat prozesu zelularra, hala nola fotosintesia, aminoazidoen metabolismoa, horma zelularren sintesia, mitosiaren erregulazioa, fitohormonen seinaleztapena edo proteinen sintesia, herbiziden helburu tipikotzat hartzen dira.Mikrotubuluen funtzioa inhibitzen duten konposatuak landareen hazkuntzan eragiten duten herbizida klase arrunta dira, erregulazio mitotikoa eraginez2.
Mikrotubulak zitoeskeletoaren osagaiak dira eta oso kontserbatuta daude zelula eukariotoetan.Tubulina heterodimeroa α-tubulina eta β-tubulinaz osatuta dago, mikrotubulu-protofilamentu linealak osatuz, eta 13 protofilamentek egitura zilindriko bat osatzen dute.Mikrotubuluek hainbat eginkizun betetzen dituzte landare-zeluletan, besteak beste, zelularen forma, zelulen zatiketa eta zelula barneko garraioa zehaztea3,4.Landare-zelulek mikrotubuluak dituzte interfasearen mintz plasmatikoaren azpian, eta mikrotubulu kortikalak deritzen hauek zelulosa-mikrofibrilen antolaketa kontrolatzen dutela uste da, zelulosa sintasa konplexuen erregulazioaren bidez4,5.Sustrai epidermiko zelulen mikrotubulu kortikalak, sustrai-muturraren luzapen azkarreko eremuan daudenak, alboan kokatzen dira, eta zelulosazko mikrozuntzek mikrotubulu horiei jarraitzen diete eta zelulen hedapenaren norabidea mugatzen dute, horrela zelulen luzapen anisotropoa sustatzen dute.Horregatik, mikrotubuluen funtzioa landareen morfologiarekin oso lotuta dago.Tubulina kodetzen duten geneetako aminoazidoen ordezkapenek mikrotubulu kortikalen multzoen okerra eta ezkerreko edo eskuineko hazkuntza eragiten dute Arabidopsis 6,7-n.Era berean, mikrotubuluen dinamika erregulatzen duten mikrotubuluei lotutako proteinen mutazioek sustraiaren hazkuntza distortsionatua ere ekar dezakete8,9,10,11,12,13.Horrez gain, disopiramida bezalako mikrotubuluak hausten dituzten herbizidekin tratatzeak, pretilaklor izenez ere ezagunak, ezkerreko sustrai zeiharra ere eragiten du14.Datu hauek adierazten dute mikrotubuluen funtzioaren erregulazio zehatza funtsezkoa dela landareen hazkuntzaren norabidea zehazteko.
Mikrotubuluen inhibitzaile mota ezberdinak aurkitu dira, eta sendagai hauek ekarpen garrantzitsuak egin dituzte zitoeskeletoaren ikerketan, baita nekazaritzan eta medikuntzan ere2.Bereziki, orizalinak, dinitroanilina konposatuek, disopiramidak, benzamidarekin erlazionatutako konposatuek eta haien analogoek mikrotubuluen funtzioa eragotzi dezakete eta, ondorioz, landareen hazkuntza galarazi dezakete.Horregatik, asko erabiltzen dira herbizida gisa.Hala ere, mikrotubuluak landare eta animalia zelulen osagai garrantzitsua direnez, mikrotubuluen inhibitzaile gehienak zitotoxikoak dira bi zelula motentzat.Hori dela eta, herbizida gisa erabilgarritasuna aitortu arren, mikrotubuluen aurkako agente kopuru mugatu bat erabiltzen da helburu praktikoetarako.
Streptomyces Streptomyces familiako genero bat da, bakterio aerobikoak, grampositiboak eta harizpikoak biltzen dituena eta oso ezaguna da bigarren mailako metabolito sorta zabala ekoizteko duen gaitasunagatik.Hori dela eta, produktu natural biologikoki aktibo berrien iturri garrantzitsuenetakotzat hartzen da.Oraingo ikerketan, kumamonamida izeneko konposatu berri bat aurkitu dugu, Streptomyces werraensis MK493-CF1 eta S. werraensis ISP 5486tik isolatuta. Analisi espektrala eta analisi espektral osoa erabiliz, kumamonamidaren egitura eta bere N-alkoxipirrol eskeleto berezia ezaugarritu ziren. zehaztu zen.sintesia.Azido ursmonikoak, ursmonoamidaren eta bere deribatuen bitarteko sintetikoak, Arabidopsis thaliana landare eredu ezagunaren hazkundea eta ernetzea inhibitzen zuela aurkitu zen.Egitura-jarduera erlazioaren azterketa batean, aurkitu dugu azido ursonikora eraldatutako C9 duen konposatu batek, azido ursonikoaren nonyloxy deribatua (KAND), nabarmen hobetzen duela hazkundearen eta ernetzearen gaineko efektu inhibitzailea.Nabarmentzekoa, aurkitu berri den landare-hazkundearen inhibitzaileak tabakoaren eta gibeleko hazkuntzan ere eragina izan zuen eta ez zen zitotoxikoa bakterioentzat edo HeLa zelulentzat.Gainera, azido urmotoniko deribatu batzuek sustraiaren fenotipo distortsionatua eragiten dute, eta ondorioz, deribatu hauek mikrotubuluetan zuzenean edo zeharka eragiten dute.Ideia horrekin bat eginez, immunohistokimikoki edo proteina fluoreszenteekin markatutako mikrotubuluen behaketek adierazten dute KAND tratamenduak mikrotubuluak despolimerizatzen dituela.Gainera, azido kumamotonikoen deribatuekin tratamenduak aktina mikrofilamentuak eten zituen.Horrela, landareen hazkuntza inhibitzaile berri bat aurkitu dugu, zeinaren ekintza-mekanismo berezia zitoeskeletoa suntsitzea dakarren.
MK493-CF1 tentsioa Shinagawa-ku, Tokioko lurzorutik isolatu zen.MK493-CF1 anduiak mizelio estromal ondo adarkatua sortu zuen.16S RNA erribosomiko genearen (1422 bp) sekuentzia partziala zehaztu zen.Andui hau S. werraensis-en oso antzekoa da (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tentsio tipikoa, %99,93).Emaitza horretan oinarrituta, tentsio hori S. werraensis motako anduiarekin lotura estua zuela zehaztu zen.Horregatik, behin-behinean S. werraensis MK493-CF1 izena jarri genion andui honi.S. werraensis ISP 5486T-k ere konposatu bioaktibo berak ekoizten ditu.Mikroorganismo honetatik produktu naturalak lortzeko ikerketa goiztiar gutxi zegoenez, ikerketa kimiko gehiago egin ziren.S. werraensis MK493-CF1 garagar-ertainean 14 egunez 30 °C-ko hartzidura solidoaren bidez landu ondoren, erdia % 50 EtOHrekin atera zen.60 ml lagin lehortu ziren 59,5 mg extract gordina lortzeko.Estraktu gordinari alderantzizko faseko HPLCri eman zitzaion N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamida (1, kumamonamida izenekoa, 36,0 mg) emateko.1-ren guztizko zenbatekoa estraktu gordinaren %60 da gutxi gorabehera.Hori dela eta, kumamotoamida 1-aren propietateak zehatz-mehatz aztertzea erabaki dugu.
Coumamonamide 1 hauts amorfo zuria da eta bereizmen handiko masa-espektrometriak (HRESIMS) C6H8N2O2 baieztatzen du (1. irudia).Konposatu honen C2 ordezkaturiko pirrol-zatiak δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H RMN espektroan) ditu: 4,5 Hz. , H-5) eta δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), eta 13C RMN espektroak lau sp2 karbono atomoren presentzia erakusten du.C2 posizioan amida talde baten presentzia HMBC korrelazioaren bidez ebaluatu zen C-3 protoitik amida karbonilo karbonora δC 161.1-n.Horrez gain, 1 H eta 13 C RMN gailurrek δH 4,10 (3H, S) eta δC 68,3-n N-metoxi taldeen presentzia adierazten dute molekulan.Metoxi taldearen posizio zuzena oraindik zehaztu ez bazen ere analisi espektroskopikoa erabiliz, hala nola diferentziaren espektroskopia hobetua eta Overhauser nuklearraren laburdura (NOEDF), N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamida izan zen lehen konposatu hautagaia.
1-ren egitura zuzena zehazteko, sintesi osoa egin zen (2a. irudia).Komertzialki eskuragarri dagoen 2-aminopiridina 2 m-CPBArekin tratatzeak dagokion N-oxidoa 3 etekin kuantitatiboa lortu zuen.2-ren 2-aminoazidazioaren ondoren, Abramovitxek deskribatutako ziklokondentsazio-erreakzioa bentzenoan burutu zen 90 °C-tan, nahi den 1-hidroxi-1H-pirrol-2-karbonitrilo 5 gramotan lortzeko.Abiadura %60 (bi etapa).15,16.4-ren metilazioa eta hidrolisiak, ondoren, 1-metoxi-1H-pirrol-2-karboxiliko azidoa eman zuen («azido kumotonikoa» deritzona 6) etekin onean (% 70, bi urrats).Azkenik, kloruro azidoaren tarteko 6 bidezko amidazioak amoniako urtsua erabiliz Kumamoto amida 1 eman zuen % 98ko etekina.1 sintetizatuaren datu espektral guztiak 1 isolatuaren antzekoak ziren, beraz, 1aren egitura zehaztu zen;
Urbenamidaren eta azido urbenikoaren jarduera biologikoaren sintesia eta analisi orokorra.(a) Kumamoto amidaren guztizko sintesia.(b) Zazpi eguneko Arabidopsis Columbia (Col) basatiaren plantulak Murashige eta Skoog (MS) plaketan hazi ziren coumamonamide 6 edo cumamonamide 1 zuten adierazitako kontzentrazioetan.Eskala barra = 1 cm.
Lehenik eta behin, urbenamidaren eta haren bitartekoen jarduera biologikoak ebaluatu ditugu landareen hazkuntza modulatzeko duten gaitasunaren arabera.Ursmonamida 1 edo 6 azido ursmonikoaren hainbat kontzentrazio gehitu dizkiogu MS agar medioari eta Arabidopsis thaliana plantulak landatu ditugu medio honetan.Entsegu hauek erakutsi zuten 6-ren kontzentrazio handiek (500 μM) sustraiaren hazkuntza inhibitzen zutela (2b. irudia).Ondoren, hainbat deribatu sortu genituen 6-ren N1 posizioa ordezkatuz eta horien gainean egitura-jarduera erlazioaren azterketak egin genituen (sintesi analogikoaren prozesua Euskarri Informazioan (SI) deskribatzen da).Arabidopsis plantulak 50 μM azido ursoniko deribatu zituen euskarri batean hazi ziren, eta sustraiaren luzera neurtu zen.irudian ikusten den bezala.3a, b eta S1 irudietan ikusten den bezala, cumamo azidoek alkoxi kate linealen (9, 10, 11, 12 eta 13) edo alkoxi kate handien (15, 16 eta 17) luzera desberdinak dituzte N1 posizioan.Deribatuek sustraiaren hazkundearen inhibizio handia erakutsi zuten.Horrez gain, 200 μM 10, 11 edo 17 aplikazioak ernetzea inhibitzen zuela ikusi genuen (3c eta S2. irudiak).
Kumamoto amidaren eta erlazionatutako konposatuen egitura-jarduera erlazioaren azterketa.(a) Analogoen egitura eta sintesi eskema.(b) 50 μM cumamonamida deribatuekin edo gabe MS euskarrian hazitako 7 eguneko landareen sustrai-luzeraren kuantifikazioa.Asteriskoek desberdintasun handiak adierazten dituzte itxurazko tratamenduarekin (t proba, or< 0,05).n>18. Datuak batez besteko ± SD gisa erakusten dira.nt-ek "ez probatu" esan nahi du, hazien % 50 baino gehiago ez baita ernetzen.(c) 7 egunez inkubatutako tratatutako hazien ernetze-abiadura kuantifikatzea 200 μM kumamonamidarekin edo gabe MS ingurunean eta erlazionatutako konposatuekin.Asteriskoek desberdintasun handiak adierazten dituzte itxurazko tratamenduarekin (chi-karratuaren proba).n=96.
Interesgarria da C9 baino luzeagoak diren alkil albo-kateak gehitzeak inhibizio-jarduera murrizten duela, azido kumamotoikoekin erlazionatutako konposatuek tamaina jakin bateko albo-kateak behar dituztela beren jarduera biologikoa erakusteko.
Egitura-jarduera erlazioaren azterketak erakusten duenez, C9 azido ursonikora aldatu zen eta azido ursonikoaren noniloxi deribatua (aurrerantzean KAND 11 deitzen dena) landareen hazkuntza inhibitzaile eraginkorrena zela, KAND 11ren karakterizazio zehatzagoa egin genuen. Arabidopsis-en tratamendua 50 μM-rekin KAND 11-k ia erabat eragotzi zuen ernetzea, eta KAND 11-ren kontzentrazio baxuagoek (40, 30, 20 edo 10 μM) sustraiaren hazkuntza inhibitu zuten dosiaren arabera (4a, b. irudia).KAND 11-k erro-meristemaren bideragarritasunari eragiten dion ala ez probatzeko, propidio ioduroz (PI) tindatutako erro-meristemak aztertu eta meristemaren eremuaren tamaina neurtu genuen.25 μM KAND-11 duen euskarri batean hazitako plantulen meristemaren tamaina 151,1 ± 32,5 μm izan zen, eta DMSO duen kontrol-euskarri batean hazitako landareen meristemaren tamaina 264,7 ± 30,8 μm (4c, d) izan zen (Irudia). , eta horrek adierazten du KAND-11k jarduera zelularra berreskuratzen duela.zabaltzen.Erro meristema.Horrekin batera, KAND 11 tratamenduak CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS seinalearen zatiketa zelularreko markatzaile kopurua murriztu zuen erro meristeman (4e. irudia) 17 .Emaitza hauek adierazten dute KAND 11k sustraiaren hazkuntza inhibitzen duela zelulen ugalketa jarduera murriztuz.
Azido urbenonikoaren deribatuek (urbeniloxi deribatuek) hazkundean duten eragin inhibitzailea aztertzea.(a) KAND 11 adierazitako kontzentrazioekin MS plaketan hazitako 7 eguneko basa motako Col plantulak. Eskala barra = 1 cm.(b) Erroaren luzeraren kuantifikazioa.Letrek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Tukey HSD test, or< 0,05).n>16. Datuak batez besteko ± SD gisa erakusten dira.(c) 25 μM edo gabe MS plaketan hazitako propidio ioduroz tindatutako Col sustraien mikroskopio konfokala. KAND 11. Kortxete zuriek sustrai-meristema adierazten dute.Eskala barra = 100 µm.(d) Erro meristemaren tamainaren kuantifikazioa (n = 10 eta 11).Desberdintasun estatistikoak t-testaren bidez zehaztu ziren (or< 0,05).Barrek meristemaren batez besteko tamaina adierazten dute.(e) CDKB2 konstrukzioa duen sustrai-meristema baten mikroskopia interferentzia-kontraste diferentziala (DIC);1pro: CDKB2;1-GUS tindatu eta tindatu zen 25 µM KAND entseguarekin edo gabe MS plaketan hazitako 5 eguneko plantuletan.
KAND 11-ren fitotoxikotasuna gehiago probatu zen beste landare dikotiledonoso bat erabiliz, tabakoa (Nicotiana tabacum), eta lurreko landare ereduko organismo nagusi bat, gibelekoa (Marchantia polymorpha) erabiliz.Arabidopsis-en kasuan bezala, 25 μM KAND 11 duten medioetan hazitako tabako SR-1 plantulek sustrai laburragoak sortu zituzten (5a. irudia).Gainera, 48 hazietatik 40 200 μM KAND 11 zuten plaketan ernetzen ziren, 48 hazi guztiak itxurazko tratatutako euskarrietan ernetzen ziren bitartean, KAND kontzentrazio handiagoak esanguratsuak zirela adieraziz (p.< 0,05;chi test -square) tabakoaren ernetzea galarazi zuen.(5b. irudia).Gainera, gibeleko bakterioen hazkuntza inhibitzen zuen KAND 11-ren kontzentrazioa Arabidopsisen kontzentrazio eraginkorraren antzekoa zen (5c. irudia).Emaitza hauek adierazten dute KAND 11-ek hainbat landareren hazkuntza galarazi dezakeela.Ondoren, hartzaren monoamidarekin erlazionatutako konposatuen zitotoxikotasuna ikertu genuen beste organismo batzuetan, hots, giza HeLa zeluletan eta Escherichia coli andui DH5α, goi mailako animalien eta bakterioen zelulen ordezkari gisa, hurrenez hurren.Zelulen ugalketa saiakuntza batzuetan, kumamonamida 1, azido kumamonamidikoa 6 eta KAND 11-k ez zutela HeLa edo E. coli zelulen hazkuntzan eraginik 100 μM-ko kontzentrazioetan (5d,e irudia).
KAND 11-aren hazkundearen inhibizioa Arabidopsis ez diren organismoetan.(a) 25 μM KAND 11 zuten MS plateretan bertikalean kokatutako MS plateretan hazi ziren bi asteko SR-1 motako tabako-plantak. 200 μM KAND 11 duten MS plakak. (c) Gamborg B5 plaketan hazitako bi asteko basati motako Tak-1 gibeleko kimuak adierazitako KAND 11 kontzentrazioekin. Gezi gorriek bi asteko inkubazioaren barruan hazteari utzi dioten esporak adierazten dituzte. aldia.(d) HeLa zelulen zelulen ugalketa saiakuntza.Zelula bideragarrien kopurua denbora-tarte finkoetan neurtu zen zelulak zenbatzeko 8. kit bat erabiliz (Dojindo).Kontrol gisa, HeLa zelulak 5 μg/ml aktinomizina Drekin (Act D) tratatu ziren, ARN polimerasa transkripzioa galarazten duena eta zelulen heriotza eragiten duena.Analisiak hirukoiztuta egin dira.(e) E. coli zelulen ugalketa azterketa.E. coli hazkundea OD600 neurtuz aztertu zen.Kontrol gisa, zelulak 50 μg/ml anpizilinarekin (Amp) tratatu ziren, bakterioen horma zelularraren sintesia galarazten duena.Analisiak hirukoiztuta egin dira.
Uramidarekin erlazionatutako konposatuek eragindako zitotoxikotasunaren ekintza-mekanismoa deszifratzeko, efektu inhibitzaile moderatuak dituzten azido urbeniko deribatuak berriro aztertu ditugu.irudian ikusten den bezala.2b, 6a irudietan erakusten den moduan, 6 azido urmotonikoaren kontzentrazio altuak (200 μM) dituzten agar-plaketan hazitako plantulek sustrai laburragoak eta ezkerreko kurbatuak sortu zituzten (θ = – 23,7 ± 6,1), kontrol-medioan hazitako plantulek, berriz, plantulek sustrai ia zuzenak sortu zituzten (θ = – 3,8 ± 7,1).Ezaugarri zeiharkako hazkuntza hau mikrotubulu kortikalen disfuntzioaren ondoriozkoa da14,18.Aurkikuntza honekin bat, mikrotubuluak ezegonkortzen dituzten disopiramidak eta orizalinak sustraiaren antzeko okertzea eragin zuten gure hazkuntza baldintzetan (2b, 6a. irudiak).Aldi berean, azido urmotoniko deribatuak probatu eta kontzentrazio jakin batzuetan sustrai zeiharkako hazkuntza eragiten zuten horietako hainbat hautatu genituen.8, 9 eta 15 konposatuek sustraiaren hazkuntzaren norabidea aldatu zuten 75 μM, 50 μM eta 40 μM-tan, hurrenez hurren, konposatu hauek mikrotubuluak modu eraginkorrean desegonkor ditzaketela adieraziz (2b, 6a. irudia).Azido ursolikoko deribaturik indartsuena, KAND 11, kontzentrazio baxuagoan (15 µM) ere probatu genuen eta KAND 11ren aplikazioak sustraiaren hazkuntza inhibitzen zuela eta sustraiaren hazkuntzaren norabidea irregularra zela ikusi genuen, nahiz eta ezkerrera makurtzeko joera izan ( C3 irudia)..Mikrotubuluak ezegonkortzen dituzten sendagaien kontzentrazio handiagoak batzuetan landareen hazkuntza inhibitzen duelako sustraiak okertzea eragin beharrean, gero KAND 11ek mikrotubuluei eragiten dien aukera baloratu genuen, sustrai epidermikoetako mikrotubulu kortikalak behatuz.25 μM KAND 11-rekin tratatutako plantulen sustraietako zelula epidermikoetan β-tubulinaren aurkako antigorputzak erabiliz immunohistokimikak erakutsi zuen luzapen-eremuko zelula epidermikoetan mikrotubulu kortikalen ia guztiak desagertzen zirela (6b. irudia).Emaitza hauek adierazten dute azido kumamotonikoak eta bere deribatuek zuzenean edo zeharka eragiten dutela mikrotubuluetan, hauek hausteko eta konposatu hauek mikrotubuluen inhibitzaile berriak direla.
Azido ursonikoak eta bere deribatuek mikrotubulu kortikalak aldatzen dituzte Arabidopsis thaliana-n.(a) Adierazitako kontzentrazioetan azido urmotoniko deribatu ezberdinen aurrean neurtutako erroaren inklinazio-angelua.Mikrotubuluak inhibitzen dituzten bi konposaturen ondorioak ere aztertu ziren: disopiramida eta orizalina.Txertaketak sustraiaren hazkuntza-angelua neurtzeko erabiltzen den estandarra erakusten du.Asteriskoek desberdintasun handiak adierazten dituzte itxurazko tratamenduarekin (t proba, or< 0,05).n>19. Eskala barra = 1 cm.(b) Mikrotubulu kortikalak luzapen eremuko zelula epidermikoetan.25 μM KAND 11 duten edo gabe MS plaketan hazitako Arabidopsis Col sustrai basatietako mikrotubulak tindaketa immunohistokimikoaren bidez bistaratu ziren β-tubulina antigorputz primarioak eta Alexa Fluor-ekin konjugatutako bigarren mailako antigorputzak erabiliz.Eskala barra = 10 µm.(c) Sustrai-meristemoko mikrotubuluen egitura mitotikoa.Mikrotubulak tindaketa immunohistokimikoa erabiliz bistaratu ziren.Egitura mitotikoak, profase-zonak, ardatzak eta fragmoplastoak barne, irudi konfokaletatik zenbatu ziren.Geziek mikrotubuluen egitura mitotikoak adierazten dituzte.Asteriskoek desberdintasun handiak adierazten dituzte itxurazko tratamenduarekin (t proba, or< 0,05).n>9. Eskala barra = 50 µm.
Ursak mikrotubuluen funtzioa hausteko gaitasuna badu ere, bere ekintza-mekanismoa mikrotubuluen despolimerizazio-agente tipikoetatik desberdina izatea espero da.Esate baterako, mikrotubuluen despolimerizazio-agenteen kontzentrazio handiagoak, hala nola disopiramida eta orizalinak, zelula epidermikoen hedapen anisotropikoa eragiten du, KAND 11-k ez duen bitartean.Horrez gain, KAND 11 eta disopiramida batera aplikatzeak disopiramideak eragindako sustrai-hazkundearen erantzun konbinatua eta KAND 11-k eragindako hazkundearen inhibizioa ikusi zen (S4. irudia).1-1 (phs1-1) disopiramida hipersentikorrak KAND 11-ren aurrean izan duen erantzuna ere aztertu dugu. phs1-1-k tubulin kinasa puntuko mutazio ez-kanonikoa du eta sustrai laburragoak sortzen ditu disopiramidarekin tratatzean9,20.KAND 11 duen agar medioan hazitako phs1-1 mutanteek disopiramidean hazitako sustrai laburragoak zituzten (S5. irud.).
Horrez gain, mikrotubulu-egitura mitotikoak ikusi ditugu, hala nola profase-zonak, ardatzak eta fragmoplastoak, KAND 11-rekin tratatutako plantulen sustrai-meristeman. mikrotubulu mitotikoen kopurua ikusi zen (.6c. irudia).
KAND 11-ren zitotoxikotasuna bereizmen azpizelularrean ezaugarritzeko, tabako BY-2 esekidura-zelulak KAND 11-rekin tratatu ditugu eta haien erantzuna ikusi dugu.Lehenengo KAND 11 gehitu genuen TagRFP-TUA6 adierazten duten BY-2 zelulei, mikrotubuluak fluoreszenteki etiketatzen dituena, KAND 11ek mikrotubulu kortikalen gainean duen eragina ebaluatzeko.Mikrotubulu kortikalen dentsitatea irudiaren analisia erabiliz ebaluatu zen, pixel zitoeskeletoen ehunekoa pixel zitoplasmatikoen artean kuantifikatu zuena.Entseguaren emaitzek erakutsi zuten ordubetez 50 μM edo 100 μM KAND 11-rekin tratatu ondoren, dentsitatea nabarmen jaitsi zela 0,94 ± 0,74% edo 0,23 ± 0,28ra, hurrenez hurren, eta DMSOrekin tratatutako zelulen dentsitatea ± 1061 ± 10. % (7a. irud.).Emaitza hauek bat datoz Arabidopsisen behaketarekin, KAND 11 tratamenduak mikrotubulu kortikalen despolimerizazioa eragiten duela (6b. irudia).BY-2 lerroa GFP-ABD markatutako aktina-harizpiekin ere aztertu genuen KAND 11-ren kontzentrazio berarekin tratatu ondoren eta KAND 11-ren tratamenduak aktina-harizpiak eten zituela ikusi genuen.50 μM edo 100 μM KAND 11-rekin egindako tratamenduak 1 orduz aktina-harizpiaren dentsitatea nabarmen murriztu zuen 1.20 ± 0.62% edo 0.61 ± 0.26%-ra, hurrenez hurren, DMSOz tratatutako zeluletan dentsitatea % 1.69 ± 0.69 ± 0.26ra izan zen.7b).Emaitza hauek aktina harizpietan eragiten ez duten propizamidaren eta latrunkulina B, mikrotubuluetan eragiten ez duen aktina despolimerizatzaile baten efektuekin kontrajartzen dira (SI S6 irudia).Horrez gain, cumamonamide 1, cumamonamide acid 6 edo KAND 11 tratamenduak ez zuen HeLa zeluletako mikrotubuletan eraginik (SI S7 irudia).Beraz, KAND 11ren ekintza-mekanismoa zitoeskeleto-disruptore ezagunen desberdina dela uste da.Gainera, KAND 11-rekin tratatutako BY-2 zelulen behaketa mikroskopikoak KAND 11 tratamenduan zehar zelulen heriotzaren hasiera agerian utzi zuen eta Evans urdinez tindatutako zelula hilen proportzioa ez zela nabarmen handitu KAND 11 tratamenduaren 30 minutu igaro ondoren, berriz, 50 μM edo 100 μM KAND-ekin 90 minutuko tratamenduaren ondoren, hildako zelulen kopurua % 43,7 edo % 80,1era igo zen, hurrenez hurren (7c. irudia).Batera hartuta, datu hauek adierazten dute KAND 11 azido ursolikoaren deribatu berria landare-zitoeskeletoaren inhibitzaile espezifikoa dela, aurretik ezezaguna den ekintza-mekanismoa duena.
KANDek mikrotubulu kortikalen, aktina-harizpietan eta tabako BY-2 zelulen bideragarritasunari eragiten die.(a) BY-2 zeluletan mikrotubulu kortikalen bistaratzea TagRFP-TUA6-ren presentzian.KAND 11 (50 μM edo 100 μM) edo DMSOrekin tratatutako BY-2 zelulak mikroskopio konfokalaren bidez aztertu ziren.Mikrotubulu kortikalen dentsitatea 25 zelula independenteren mikrografietatik kalkulatu zen.Letrek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Tukey HSD test, or< 0,05).Eskala barra = 10 µm.(b) Aktina kortikalen harizpiak BY-2 zeluletan GFP-ABD2-ren presentzian ikusitakoak.KAND 11 (50 μM edo 100 μM) edo DMSOrekin tratatutako BY-2 zelulak mikroskopio konfokalaren bidez aztertu ziren.Aktina kortikalen harizpien dentsitatea 25 zelula independenteren mikrografietatik kalkulatu zen.Letrek desberdintasun esanguratsuak adierazten dituzte (Tukey HSD test, or< 0,05).Eskala barra = 10 µm.(c) Hildako BY-2 zelulen behaketa Evans urdinaren tindaketa bidez.KAND 11 (50 μM edo 100 μM) edo DMSOrekin tratatutako BY-2 zelulak eremu distiratsuko mikroskopiarekin aztertu ziren.n=3.Eskala barra = 100 µm.
Produktu natural berrien aurkikuntzak eta aplikazioak aurrerapen garrantzitsuak ekarri ditu gizakiaren bizitzako hainbat alderditan, medikuntzan eta nekazaritzan barne.Natur baliabideetatik konposatu erabilgarriak lortzeko ikerketa historikoak egin dira.Bereziki, aktinomizetoak nematodoentzako antiparasitoen aurkako antibiotiko gisa erabilgarriak direla ezagutzen da, bigarren mailako hainbat metabolito ekoizteko duten gaitasunagatik, hala nola avermectina, ivermektinaren eta bleomizinaren konposatu beruna eta haren deribatuak, sendagai minbiziaren aurkako agente gisa erabiltzen direnak21,22.Era berean, aktinomizetoetatik hainbat konposatu herbizida aurkitu dira, eta horietako batzuk dagoeneko merkataritzan erabiltzen dira1,23.Horregatik, aktinomizetoen metabolitoen analisia estrategia eraginkortzat hartzen da nahi diren jarduera biologikoak dituzten produktu naturalak isolatzeko.Ikerketa honetan, S. werraensis-etik konposatu berri bat aurkitu dugu, cumamonamida, eta arrakastaz sintetizatu dugu.Azido ursonikoa urbenamidaren eta bere deribatuen bitarteko sintetikoa da.Sustrai-kizkurdura bereizgarria eragin dezake, jarduera herbizida moderatua edo indartsua izan dezake eta landareen mikrotubuluak zuzenean edo zeharka kaltetu ditzake.Hala ere, azido urmotonikoaren ekintza-mekanismoa lehendik dauden mikrotubuluen inhibitzaileenetik desberdina izan daiteke, izan ere, KAND 11-k aktina-harizpiak ere apurtzen ditu eta zelulen heriotza eragiten du, azido urmotonikoak eta bere deribatuek zitoeskeleto-egitura ugari eragiten duten mekanismo erregulatzaile bat iradokitzen baitu..
Azido urbenonikoaren ezaugarri zehatzagoak azido urbenonikoaren ekintza-mekanismoa hobeto ulertzen lagunduko du.Bereziki, hurrengo helburua da azido ursonikoak mikrotubulu murriztuetara lotzeko duen gaitasuna ebaluatzea, azido ursonikoak eta bere deribatuak mikrotubuluetan zuzenean eragiten duten eta haiek despolimerizatzeko, edo haien ekintzak mikrotubuluak ezegonkortzen dituen jakiteko.Horrez gain, mikrotubuluak helburu zuzena ez diren kasuetan, landare-zeluletan azido ursonikoaren ekintza-gunea eta helburu molekularrak identifikatzeak erlazionatutako konposatuen propietateak eta jarduera herbizida hobetzeko modu posibleak hobeto ulertzen lagunduko du.Gure bioaktibitatearen azterketak Arabidopsis thaliana, tabakoa eta gibeleko landareen hazkuntzan azido ursonikoak duen gaitasun zitotoxiko berezia agerian utzi zuen, eta ez E. coli ez HeLa zelulek ez zuten eraginik izan.Animalia-zelulentzako toxikotasun gutxi edo bat ere ez da azido ursonikoaren deribatuen abantaila bat, nekazaritza eremu irekietan erabiltzeko herbizida gisa garatzen badira.Izan ere, mikrotubulak eukariotoetan ohikoak diren egiturak direnez, landareetan haien inhibizio selektiboa herbizidetarako funtsezko baldintza da.Adibidez, propyzamida, mikrotubuluen despolimerizazio-agentea, tubulinari zuzenean lotzen zaiona eta polimerizazioa galarazten duena, herbizida gisa erabiltzen da animalia-zelulekiko toxikotasun txikia duelako24.Disopiramidarekin alderatuta, erlazionatutako benzamidek helburu berezitasun desberdinak dituzte.Landareen mikrotubuluez gain, RH-4032 edo benzoxamideak animalia-zelulen edo oomizetoen mikrotubuluak ere inhibitzen ditu, hurrenez hurren, eta zalilamida fungizida gisa erabiltzen da fitotoxikotasun txikia duelako25,26,27.Aurkitu berri den hartzak eta bere deribatuek landareen aurkako zitotoxikotasun selektiboa erakusten dute, baina nabarmentzekoa da aldaketa gehiagok beren xedearen espezifikotasuna alda dezaketela, onddo edo oomizeto patogenoak kontrolatzeko deribatu osagarriak eman ditzaketela.
Azido urbenonikoaren eta bere deribatuen propietate bereziak baliagarriak dira herbizida gisa garatzeko eta ikerketa-tresna gisa erabiltzeko.Oso ezaguna da zitoeskeletoak landare-zelulen forma kontrolatzeko duen garrantzia.Aurretik egindako ikerketek erakutsi dute landareek mikrotubuluen antolamendu kortikalen mekanismo konplexuak garatu dituztela mikrotubuluen dinamika kontrolatuz, morfogenesia behar bezala kontrolatzeko.Mikrotubuluen jardueraren erregulazioaz arduratzen diren molekula ugari identifikatu dira, eta horrekin lotutako ikerketak abian dira oraindik3,4,28.Landare-zeluletan mikrotubuluen dinamikaren egungo ulermenak ez ditu guztiz azaltzen mikrotubuluen antolakuntza kortikalen mekanismoak.Esate baterako, disopiramidak eta orizalinak mikrotubuluak despolimerizatu ditzaketen arren, disopiramidak sustraiaren distortsio larria eragiten du, orizalinak eragin nahiko arina du.Gainera, mikrotubuluak egonkortzen dituen tubulinaren mutazioek dextrorotazioa ere eragiten dute sustraietan, eta paclitaxelek, mikrotubuluen dinamika ere egonkortzen duenak, ez.Hori dela eta, azido ursolikoaren xede molekularrak aztertzeak eta identifikatzeak argibide berriak eman beharko lituzke landareen mikrotubulu kortikalen erregulazioari buruz.Era berean, hazkunde distortsionatua sustatzeko eraginkorrak diren produktu kimikoen etorkizuneko konparaketak, hala nola disopiramida, eta eraginkortasun gutxiagoko produktu kimikoak, hala nola orizalina edo azido kumamotorikoa, hazkuntza distortsionatua nola gertatzen den jakiteko argibideak emango ditu.
Bestalde, defentsari lotutako zitoeskeletoen berrantolaketak azido ursonikoaren zitotoxikotasuna azaltzeko beste aukera bat dira.Patogeno baten infekzioak edo elizitore bat landare-zeluletan sartzeak zenbaitetan zitoeskeletoa suntsitzea eta ondorengo zelulen heriotza eragiten du29.Esate baterako, oomizetoetatik eratorritako kriptoxantinak mikrotubuluak eta aktina-harizpiak hausten dituela jakinarazi da tabako-zelulak hil baino lehen, KAND tratamenduarekin gertatzen denaren antzera30,31.Defentsa-erantzunen eta azido ursonikoak eragindako zelulen erantzunen arteko antzekotasunek zelula-prozesu arruntak abiarazten dituztela hipotesia egitera eraman gaitu, nahiz eta kriptoxantina baino azido ursonikoaren eragin azkarrago eta indartsuagoa den.Hala ere, ikerketek frogatu dute aktina-harizpien hausteak zelulen heriotza espontaneoa sustatzen duela, eta hori ez da beti mikrotubuluen hausturarekin batera29.Horrez gain, patogenoak edo elizitzaileak sustraiaren hazkuntza distortsionatua eragiten duen ala ez ikusteko dago, azido ursonikoen deribatuek egiten duten bezala.Beraz, defentsa-erantzunak eta zitoeskeletoa lotzen dituen ezagutza molekularra jorratu beharreko arazo erakargarria da.Azido ursonikoarekin erlazionatutako pisu molekular baxuko konposatuen presentziaz baliatuz, baita potentzia desberdinak dituzten deribatu sorta ere, zelula-mekanismo ezezagunak bideratzeko aukerak eman ditzakete.
Batera hartuta, mikrotubuluen dinamika modulatzen duten konposatu berrien aurkikuntzak eta aplikazioak metodo indartsuak emango ditu landare-zelulen forma zehaztearen azpian dauden mekanismo molekular konplexuei aurre egiteko.Testuinguru honetan, berriki garatu den azido urmotoniko konposatuak, mikrotubuluei eta aktina-harizpiei eragiten die eta zelulen heriotza eragiten duenak, mikrotubuluen kontrolaren eta beste mekanismo horien arteko lotura deszifratzeko aukera eman dezake.Horrela, azido urbenonikoa erabiliz analisi kimiko eta biologikoak landareen zitoeskeletoa kontrolatzen duten erregulazio-mekanismo molekularrak ulertzen lagunduko digu.
Inokulatu S. werraensis MK493-CF1 500 ml-ko erlenmeyer matraze batean, %2 (p/v) galaktosa, %2 (w/v) esentzia-pasta, %1 (w/v) Bacto konposizioa dituen 110 ml hazi-euskarriarekin. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), %0,5 (w/v) arto-estraktua (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), %0,2 (w/v) (NH4)2SO4 eta %0,2 CaCO3 ur deionizatuetan.(pH 7,4 esterilizatu aurretik).Hazi-kulturak astingailu birakari batean (180 rpm) 27 °C-tan inkubatu ziren 2 egunez.Ekoizpen-hazkuntza egoera solidoko hartziduraren bidez.Hazi-kultura (7 ml) 500 ml-ko K-1 matraze batera transferitu zen, 15 g garagar prentsatuz (MUSO Co., Ltd., Japonia) eta 25 g ur deionizatuz (pH egokitu gabe) osatutako 40 g produkzio-euskarriarekin. esterilizatu aurretik).).Hartzidura 30 °C-tan egin zen ilunpetan 14 egunez.Hartzidura-materiala 40 ml/botila EtOHrekin atera eta zentrifugatu zen (1500 g, 4°C, 10 min).Kultura gainditzailea (60 ml) %10 MeOH/EtOAc nahasketa batekin atera zen.Geruza organikoa presio murriztuan lurrundu zen hondakin bat lortzeko (59,5 mg), eta HPLC-a jasan zuen gradiente eluzioarekin (0-10 minutu: % 90) alderantzizko faseko zutabe batean (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × luzera 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutu: % 90 H2O/CH3CN % 70 H2O/CH3CN (gradientea), 35–45 minutu: % 90 H2O/EtOH, 45–155 minutu: % 90 H2O /EtOH % 100 EtOH-ra (gradientea (gradientea), 155-200 min: % 100 EtOH) 1,5 ml/min-ko emariarekin, kumamonamida (1, 36,0 mg) hauts amorfo zuri gisa isolatu zen.
Kumamotoamida(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkulatutako balioa: 141,0659, neurtutako balioa: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1537
Columbiako haziak (Col-0) Arabidopsis Biological Resource Centerretik (ABRC) lortu ziren ikerketa erabiltzeko baimenarekin.Col-0 haziak gure laborategiko baldintzetan hedatu eta mantendu ziren eta Arabidopsis landare basati gisa erabili ziren.Arabidopsis haziak gainazalean esterilizatu eta hazi ziren Murashige eta Skoog medio indar erdian %2 sakarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), %0,05 (w/v) 2-(4-morfolino)etanosulfoniko azido (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) eta % 1,5eko agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C-tan eta argi etengabean.Phs1-1 mutantearen haziak T. Hashimotok (Nara Institute of Science and Technology) eman zituen.
SR-1 anduiaren haziak T. Hashimotok (Nara Institute of Science and Technology) eman zituen eta basati-mota tabako landare gisa erabili zituen.Tabako-haziak gainazalean esterilizatu eta ur esteriluan busti zituzten hiru gauez ernetzea sustatzeko, eta gero indar erdiko disoluzio batean jarri ziren, %2 sakarosa, %0,05 (w/v) MES eta %0,8 gellan goma (Fujifilm Wako Pure Chemical) dituena. Murashige.eta Skoog medium) pH 5,7koa eta 23°C-tan inkubatua argi etengabean.
Tak-1 tentsioa T. Kohchi-k (Kyotoko Unibertsitatea) eman zuen eta gibeleko ikerketarako unitate esperimental estandar gisa erabili zen.Gemma landare esterilizatuetatik lortu eta gero Gamborg B5 euskarrian (Fujifilm Wako Pure Chemical) % 1 sakarosa eta % 0,3 gellan goma zituena eta 23 °C-tan inkubatu zen etengabeko argipean.
Tabako BY-2 zelulak (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa-k (Tokioko Unibertsitatea) eman zituen.BY-2 zelulak 95 aldiz diluitu ziren Linsmeier eta Skoog eraldatuan eta astero azido 2,4-diklorofenoxiazetikoarekin osatu ziren 32 .Zelula esekidura astingailu birakari batean nahastu zen 130 rpm-tan 27 °C-tan ilunpetan.Garbitu zelulak euskarri freskoaren bolumenaren 10 aldiz gehiagorekin eta suspentsatu berriro euskarri berean.BY-2 zelula-lerro transgenikoak TagRFP-TUA6 mikrotubulu-markatzailea edo GFP-ABD2 aktina-harizpi-markatzailea azalorearen mosaiko birusaren 35S sustatzailearen azpian azaltzen diren bezala sortu ziren33,34,35.Zelula-lerro hauek mantendu eta sinkroniza daitezke jatorrizko BY-2 zelula-lerrorako erabiltzen direnen antzeko prozedurak erabiliz.
HeLa zelulak Dulbecco-ren Eagle's medium (DMEM) eraldatuan (Life Technologies) hazi ziren, %10 fetal behi-serumarekin, 1,2 U/ml penizilina eta 1,2 μg/ml estreptomizina 37°C-ko inkubagailu batean, %5 CO2-arekin.
Eskuizkribu honetan deskribatutako esperimentu guztiak Japoniako biosegurtasun araudi eta jarraibideen arabera egin ziren.
Konposatuak dimetil sulfoxidoan (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) disoluzio gisa disolbatu ziren eta MS ingurunean diluitu ziren Arabidopsis eta tabakorako edo Gamborg B5 gibelerako.Sustraiaren hazkuntza inhibitzeko saiakuntzarako, plaka bakoitzeko 10 hazi baino gehiago erein ziren adierazitako konposatuak edo DMSO zituen agar-erdian.Haziak hazkuntza-ganbera batean inkubatu ziren 7 egunez.Plantulei argazkiak atera eta sustraien luzera neurtu zen.Arabidopsis ernetze-saiakuntzarako, plaka bakoitzeko 48 hazi erein ziren 200 μM konposatu edo DMSO zituen agar medioan.Arabidopsis haziak hazkuntza-ganbera batean hazi ziren eta ernetutako plantulen kopurua ernetu eta 7 egun geroago zenbatu zen (dag).Tabakoaren ernetze-saiakuntzarako, plaka bakoitzeko 24 hazi erein ziren 200 μM KAND edo DMSO zituen agar medioan.Tabako-haziak hazkuntza-ganbera batean hazi ziren eta 14 egun igaro ondoren ernetutako plantulen kopurua zenbatu zen.Gibeleko hazkuntza inhibitzeko saiakuntzarako, plaka bakoitzeko 9 enbrioi KAND edo DMSOren kontzentrazio adieraziak zituen agar-erdian plateratu ziren eta hazkuntza-ganbera batean inkubatu ziren 14 egunez.
Erabili 5 mg/ml propidio ioduroarekin (PI) tindatutako plantulak sustrai meristemen antolaketa ikusteko.PI seinaleak fluoreszentzia-mikroskopiaz behatu ziren, TCS SPE laser bidezko eskaneatzeko mikroskopio konfokala erabiliz (Leica Microsystems).
Sustraien β-glucuronidasa (GUS) tindaketa histokimikoa Malami eta Benfey-k deskribatutako protokoloaren arabera egin zen.Plantulak % 90eko azetonan finkatu ziren gau osoan, 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolil-β-d-glukuroniko azidoarekin zikindu GUS tamponean ordubetez eta kloraldehido disoluzio hidratatu batean jarri.(8 g kloral hidrato, 2 ml ur eta 1 ml glizerola) eta interferentzia diferentzialaren kontraste mikroskopioaren bidez behatu Axio Imager M1 mikroskopioa erabiliz (Carl Zeiss).
Sustraien angeluak neurtu ziren bertikalki jarritako plaketan hazitako 7 eguneko plantuletan.Neurtu erroaren angelua grabitate-bektorearen norabidetik 6. urratsean deskribatutako moduan.
Mikrotubulu kortikalen antolaketa deskribatu bezala ikusi zen, protokoloan aldaketa txikiekin 37 .Anti-β-tubulin antigorputz (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) eta Alexa Fluor 488-konjugatutako saguaren aurkako IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) antigorputz primario eta sekundario gisa erabili ziren 1:1000 eta 1:100 diluzioetan, hurrenez hurren.Fluoreszentzia-irudiak TCS SPE laser eskaneatzeko mikroskopio konfokal baten bidez eskuratu ziren (Leica Microsystems).Lortu Z-stack irudiak eta sortu intentsitate maximoko proiekzioak fabrikatzailearen argibideen arabera.
HeLa zelulen ugalketa saiakuntza Cell Counting Kit 8 (Dojindo) erabiliz egin zen fabrikatzailearen argibideen arabera.
E. coli DH5α-ren hazkundea kulturan zelula-dentsitatea neurtuz 600 nm-ko (OD600) espektrofotometroa erabiliz aztertu zen.
BY-2 zelula transgenikoetako zitoeskeletoaren antolaketa ikusi zen CSU-X1 eskaneatzeko gailu konfokal batekin (Yokogawa) eta sCMOS kamera batekin (Zyla, Andor Technology) hornitutako fluoreszentzia mikroskopio batekin.Zitoeskeletoaren dentsitatea irudien analisiaren bidez ebaluatu zen, irudi konfokaletako pixel zitoplasmatikoen artean zitoeskeletoen pixelen ehunekoa kuantifikatu zuen ImageJ softwarea erabiliz deskribatu bezala38,39.
BY-2 zeluletan zelulen heriotza detektatzeko, zelulen esekiduraren alikuota bat Evans urdin % 0,05arekin inkubatu zen 10 minutuz giro-tenperaturan.Hildako zelulen Evans urdinaren tindaketa selektiboa zelula bideragarrietatik tindagaiaren estrusioaren araberakoa da mintz plasmatiko osorik40.Zelula zikinduak eremu distiratsuko mikroskopio baten bidez behatu ziren (BX53, Olympus).
HeLa zelulak % 10eko FBSrekin osaturiko DMEMn hazi ziren 37 ° C-tan eta % 5 CO2-ko inkubagailu heze batean.Zelulak 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) edo 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 orduz 37 °C-tan tratatu ziren.Zelulak MetOHrekin finkatu ziren 10 minutuz eta gero azetatoarekin 5 minutuz giro-tenperaturan.Zelula finkoak β-tubulin antigorputz primarioarekin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) % 0,5 BSA/PBS-an diluituta inkubatu ziren 2 orduz, 3 aldiz garbitu TBSTrekin eta, ondoren, Alexa Fluor ahuntz antigorputzarekin inkubatu ziren.488 1 ordu.– Saguaren IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) eta 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) % 0,5 BSA/PBStan diluitua.TBSTrekin hiru aldiz garbitu ondoren, zikindutako zelulak ikusi ziren Nikon Eclipse Ti-E alderantzizko mikroskopioan.Irudiak Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera hoztu batekin atera ziren MetaMorph softwarea (Molecular Devices) erabiliz.
Argitalpenaren ordua: 2024-06-17