Pinu nematodoa pinudi-ekosistemetan galera ekonomiko larriak eragiten dituen berrogeialdiko endoparasito migratzailea da. Oraingo ikerketak indol halogenatuen jarduera nematizida pinu nematodoen aurka eta haien ekintza-mekanismoa aztertzen ditu. 5-iodoindolaren eta avermektinaren (kontrol positiboa) jarduera nematizidak pinu nematodoen aurka antzekoak eta altuak izan ziren kontzentrazio baxuetan (10 μg/mL). 5-iodoindolak ugalkortasuna, ugalketa-jarduera, enbrioi- eta larben hilkortasuna eta lokomozio-portaera murriztu zituen. Ligandoen eta ornogabeentzako glutamato-mendeko kloruro-kanalen hartzaileen arteko elkarrekintza molekularrek 5-iodoindolak, avermektinak bezala, hartzaileen gune aktiboari estu lotzen zaiola dioen ideia babesten dute. 5-iodoindolak hainbat deformazio fenotipiko ere eragin zituen nematodoetan, besteak beste, organoen kolapso/txikitze anormala eta bakuolizazio-igoera. Emaitza hauek iradokitzen dute bakuoloek zeresana izan dezaketela nematodoen metilazio bidezko heriotzan. Garrantzitsua da, 5-iodoindola ez zela toxikoa landare-espezieentzat (aza eta errefaua). Beraz, ikerketa honek erakusten du ingurumen-baldintzetan iodoindola aplikatzeak pinuaren ihartzearen kaltea kontrola dezakeela.
Pinu-egurraren nematodoa (Bursaphelenchus xylophilus) pinu-egurraren nematodoen (PWN) taldekoa da, pinu-basoen ekosistemei kalte ekologiko larriak eragiten dizkieten nematodo endoparasito migratzaileak1. Pinu-egurraren nematodoak eragindako pinu-ihartzearen gaixotasuna (PWD) arazo larria bihurtzen ari da hainbat kontinentetan, Asian eta Europan barne, eta Ipar Amerikan, nematodoak sartutako pinu-espezieak suntsitzen ditu1,2. Pinu-zuhaitzen gainbehera arazo ekonomiko handia da, eta mundu osoan hedatzeko aukera kezkagarria da3. Nematodoak gehien erasotzen dituen pinu-espezie hauek dira: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii eta Pinus radiata4. Pinu-nematodoa gaixotasun larria da, infekzioaren ondorengo aste edo hilabeteetan pinuak hil ditzakeena. Gainera, pinu-nematodoen agerraldiak ohikoak dira hainbat ekosistematan, beraz, infekzio-kate iraunkorrak ezarri dira1.
Bursaphelenchus xylophilus Aphelenchoidea superfamiliako eta 102.5 kladeko landare-parasito nematodo bat da, berrogeialdian. Nematodoak onddoez elikatzen da eta pinuen zurezko ehunetan ugaltzen da, lau larba-estadio desberdinetan garatuz: L1, L2, L3, L4 eta heldu bat1,6. Janari-eskasia dagoenean, pinu-nematodoa larba-estadio espezializatu batera igarotzen da –dauer–, eta honek bere bektorea –pinu-azaleko kakalardoa (Monochamus alternatus) parasitatzen du eta pinu osasuntsuetara transferitzen da. Ostalari osasuntsuetan, nematodoek azkar migratzen dute landare-ehunetan zehar eta zelula parenkimatosoez elikatzen dira, eta horrek hipersentikortasun-erreakzio ugari, pinuaren ihartzea eta heriotza eragiten ditu infekzioaren ondorengo urtebeteko epean1,7,8.
Pinu nematodoen kontrol biologikoa aspalditik izan da erronka bat, XX. mendeko berrogeialdi neurriak ezarri baitira. Pinu nematodoak kontrolatzeko egungo estrategiek batez ere tratamendu kimikoak erabiltzen dituzte, besteak beste, egurra fumigantzea eta nematizidak zuhaitzen enborretan ezartzea. Nematizida erabilienak avermektina eta avermektina benzoatoa dira, avermektina familiakoak. Produktu kimiko garesti hauek oso eraginkorrak dira nematodo espezie askoren aurka eta ingurumenerako seguruak direla uste da9. Hala ere, nematizida hauen erabilera errepikatuak hautespen presioa sortzea espero da, eta horrek ia ziur aski pinu nematodo erresistenteak agertzea ekarriko du, hainbat intsektu izurriterentzat frogatu den bezala, hala nola Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella eta Trichostrongylus colubriformis eta Ostertagia circumcincta nematodoentzat, pixkanaka avermektinekiko erresistentzia garatu baitute10,11,12. Beraz, erresistentzia ereduak aldizka aztertu behar dira eta nematizidak etengabe aztertu behar dira PVD kontrolatzeko neurri alternatiboak, kostu-eraginkorrak eta ingurumenerako errespetuzkoak aurkitzeko. Azken hamarkadetan, hainbat egilek landare-estraktuak, olio esentzialak eta lurrunkorrak erabiltzea proposatu dute nematodoen kontrol-agente gisa13,14,15,16.
Duela gutxi frogatu dugu indolaren jarduera nematizida, zelula arteko eta erreinu arteko seinaleztapen molekula bat, Caenorhabditis elegans-en 17. Indola zelula barneko seinale oso zabaldua da ekologia mikrobianoan, fisiologia mikrobianoan, esporen eraketan, plasmidoen egonkortasunean, sendagaien erresistentzian, biofilmen eraketan eta birulentzian eragina duten funtzio ugari kontrolatzen dituena 18, 19. Indolaren eta bere deribatuen jarduera beste nematodo patogeno batzuen aurka ez da aztertu. Ikerketa honetan, 34 indolen jarduera nematizida ikertu dugu pinu nematodoen aurka, eta 5-iodoindol indartsuenaren ekintza-mekanismoa argitu dugu mikroskopia, denbora-tarteko argazkiak eta lotura molekularreko esperimentuak erabiliz, eta landareengan dituen efektu toxikoak ebaluatu ditugu hazien ernetze-analisi bat erabiliz.
Indol kontzentrazio altuek (>1.0 mM) nematodoengan efektu nematizida dutela jakinarazi da lehenago17. B. xylophilus (bizitza-etapa mistoak) indolarekin edo 33 indol deribatu desberdinekin 1 mM-tan tratatu ondoren, B. xylophilus-en hilkortasuna neurtu zen kontrol-taldeetan eta tratatutako taldeetan nematodo biziak eta hilak zenbatuz. Bost indolek jarduera nematizida esanguratsua erakutsi zuten; tratatu gabeko kontrol-taldearen biziraupena % 95 ± 7koa izan zen 24 ordu igaro ondoren. Probatutako 34 indoletatik, 5-iodoindolak eta 4-fluoroindolak 1 mM-tan % 100eko hilkortasuna eragin zuten, eta 5,6-difluoroindigoak, metilindol-7-karboxilatoak eta 7-iodoindolak, berriz, % 50 inguruko hilkortasuna eragin zuten (1. taula).
5-iodoindolaren eragina pinu-egurrezko nematodoaren bakuoloen eraketan eta metabolismoan. (A) Avermektina eta 5-iodoindolaren eragina nematodo ar helduengan, (B) L1 estadioko nematodoen arrautzak eta (C) B. xylophilus-en metabolismoa, (i) ez ziren bakuoloak ikusi 0 ordutan, tratamenduak (ii) bakuoloak, (iii) bakuolo anitzen metaketa, (iv) bakuoloen hantura, (v) bakuoloen fusioa eta (vi) bakuolo erraldoien eraketa eragin zituen. Gezi gorriek bakuoloen hantura adierazten dute, gezi urdinek bakuoloen fusioa eta gezi beltzek bakuolo erraldoiak. Eskala-barra = 50 μm.
Horrez gain, ikerketa honek pinu nematodoetan metanoak eragindako heriotzaren prozesu sekuentziala ere deskribatu zuen (4C irudia). Heriotza metanogenikoa zelula-heriotza mota ez-apoptotikoa da, zitoplasmako bakuolo nabarmenen metaketarekin lotuta27. Pinu nematodoetan behatutako akats morfologikoak metanoak eragindako heriotzaren mekanismoarekin estuki lotuta daudela dirudi. Denbora ezberdinetan egindako azterketa mikroskopikoak erakutsi zuen bakuolo erraldoiak sortu zirela 5-iodoindolaren (0,1 mM) eraginpean 20 ordu igaro ondoren. Bakuolo mikroskopikoak ikusi ziren 8 orduko tratamenduaren ondoren, eta haien kopurua handitu egin zen 12 ordu igaro ondoren. Hainbat bakuolo handi ikusi ziren 14 ordu igaro ondoren. Hainbat bakuolo fusionatu argi ikusten ziren 12-16 orduko tratamenduaren ondoren, eta horrek adierazten du bakuoloen fusioa dela heriotza metanogenikoaren mekanismoaren oinarria. 20 ordu igaro ondoren, hainbat bakuolo erraldoi aurkitu ziren zizare osoan. Behaketa hauek C. elegans-en metuosiaren lehen txostena adierazten dute.
5-iodoindolarekin tratatutako zizareetan, bakuoloen agregazioa eta haustura ere ikusi ziren (5. irudia), zizareen tolesturak eta ingurumenera askatzeak frogatzen duten bezala. Bakuoloen haustura ere ikusi zen arrautza-oskolaren mintzean, normalean L2-k osorik mantentzen duena eklosioan zehar (S2 irudi osagarria). Behaketa hauek fluidoen metaketaren eta osmoregulazio-hutsegitearen, baita zelulen lesio itzulgarriaren (RCI) parte hartzea berresten dute bakuoloen eraketa eta supurazio prozesuan (5. irudia).
Iodoak behatutako bakuoloen eraketan duen eginkizuna hipotesizatuz, sodio ioduroaren (NaI) eta potasio ioduroaren (KI) jarduera nematizida ikertu genuen. Hala ere, kontzentrazioetan (0,1, 0,5 edo 1 mM), ez zuten eraginik izan ez nematodoen biziraupenean ezta bakuoloen eraketan ere (S5 irudi osagarria), nahiz eta 1 mM-ko KI-k efektu nematizida txikia izan. Bestalde, 7-iodoindolak (1 edo 2 mM), 5-iodoindolak bezala, bakuolo anitz eta deformazio estrukturalak eragin zituen (S6 irudi osagarria). Bi iodoindolek antzeko ezaugarri fenotipikoak erakutsi zituzten pinu nematodoetan, NaI-k eta KI-k, berriz, ez. Interesgarria da, indolak ez zuen bakuoloen eraketa eragin B. xylophilus-en probatutako kontzentrazioetan (datuak ez dira erakusten). Beraz, emaitzek baieztatu zuten indol-iodo konplexua dela B. xylophilus-en bakuolizazio eta metabolismoaren arduraduna.
Jarduera nematizida aztertutako indolen artean, 5-iodoindolak izan zuen irristatze-indizerik altuena, -5,89 kcal/mol, ondoren 7-iodoindola (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindola (-4,33) eta indola (-4,03) etorri zirelarik (6. irudia). 5-iodoindolak leuzinarekin 218 duen hidrogeno-lotura sendoak bere lotura egonkortzen du, eta gainerako indol-deribatu guztiek, berriz, serina 260ri alboko kate hidrogeno-loturen bidez lotzen zaizkio. Beste iodoindol modelatuen artean, 2-iodoindolak -5,248 kcal/mol-ko lotura-balioa du, leuzina 218-rekin duen hidrogeno-lotura nagusiari zor zaiona. Beste lotura ezagun batzuk 3-iodoindola (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindola (-4,0 kcal/mol) eta 6-fluoroindola (-2,6 kcal/mol) dira (S8 irudi osagarria). Indol halogenatu gehienek eta indolak berak, 5-iodoindola eta 2-iodoindola izan ezik, lotura bat osatzen dute serina 260-rekin. Leuzina 218-rekin hidrogeno loturak errezeptore-ligando lotura eraginkorra adierazten du, ivermektinarentzat ikusi den bezala (S7. irudi osagarria), eta horrek baieztatzen du 5-iodoindolak eta 2-iodoindolak, ivermektina bezala, GluCL errezeptorearen gune aktiboari lotzen zaizkiola leuzina 218-ren bidez (6. irudia eta S8. irudi osagarria). Proposatzen dugu lotura hau beharrezkoa dela GluCL konplexuaren poro irekien egitura mantentzeko eta GluCL errezeptorearen gune aktiboari lotuz, 5-iodoindolak, 2-iodoindolak, avermektinak eta ivermektinak ioi kanala irekita mantentzen dutela eta fluidoen xurgapena ahalbidetzen dutela.
Indolaren eta indol halogenatuaren lotura molekularra GluCL-ra. (A) indolaren, (B) 4-fluoroindolaren, (C) 7-iodoindolaren eta (D) 5-iodoindol ligandoen lotura-orientazioak GluCL-ren gune aktiboari. Proteina zinta batez irudikatzen da, eta bizkarrezurraren hidrogeno-loturak lerro hori puntuatuekin erakusten dira. (A′), (B′), (C′) eta (D′) ligandoek inguruko aminoazido-hondakinekin dituzten elkarrekintzak erakusten dituzte, eta alboko kateko hidrogeno-loturak gezi arrosa puntuatuekin adierazten dira.
Esperimentuak egin ziren 5-iodoindolak aza eta errefau hazien ernetzean zuen eragin toxikoa ebaluatzeko. 5-iodoindolak (0,05 edo 0,1 mM) edo avermektinak (10 μg/mL) eragin txikia edo batere ez zuten izan hasierako ernetzean eta landareen agerpenean (7. irudia). Gainera, ez zen alde esanguratsurik aurkitu tratatu gabeko kontrolen ernetze-tasaren eta 5-iodoindolarekin edo avermektinarekin tratatutako hazien artean. Sustrai nagusien luzapenean eta sortutako alboko sustraien kopuruan izandako eragina hutsala izan zen, nahiz eta 5-iodoindolaren 1 mM-k (bere kontzentrazio aktiboaren 10 aldiz) alboko sustraien garapena apur bat atzeratu zuen. Emaitza hauek adierazten dute 5-iodoindola ez dela toxikoa landare-zelulentzat eta ez duela landareen garapen-prozesuetan eraginik izaten aztertutako kontzentrazioetan.
5-iodoindolaren eragina hazien ernetzean. B. oleracea eta R. raphanistrum hazien ernetzea, kimatzea eta alboko sustraiak sortzea Murashige eta Skoog agar ingurunean, avermektina edo 5-iodoindolarekin edo gabe. Ernetzea 22 °C-tan 3 eguneko inkubazioaren ondoren erregistratu zen.
Ikerketa honek indolek nematodoak hiltzeko hainbat kasuren berri ematen du. Garrantzitsua da hau dela iodoindolak pinu-orratzen metilazioa eragiten duen lehen txostena (bakuolo txikien metaketak eragindako prozesua, pixkanaka bakuolo erraldoietan bat egiten dutenak, azkenean mintz-haustura eta heriotza eraginez), iodoindolak avermektina nematozida komertzialaren antzeko propietate nematizida esanguratsuak erakusten dituelarik.
Aurretik jakinarazi da indolek seinaleztapen-funtzio ugari betetzen dituztela prokarioto eta eukariotoetan, besteak beste, biofilmen inhibizioa/eraketa, bakterioen biziraupena eta patogenizitatea19,32,33,34. Duela gutxi, indol halogenatuen, indol alkaloideen eta indol deribatu erdisintetikoen efektu terapeutiko potentzialek ikerketa-interes handia piztu dute35,36,37. Adibidez, frogatu da indol halogenatuek Escherichia coli eta Staphylococcus aureus zelula iraunkorrak hiltzen dituztela37. Horrez gain, interes zientifikoa du indol halogenatuen eraginkortasuna aztertzea beste espezie, genero eta erreinu batzuen aurka, eta ikerketa hau helburu hori lortzeko urrats bat da.
Hemen, C. elegans-en 5-iodoindolak eragindako hilkortasunerako mekanismo bat proposatzen dugu, zelula-lesio itzulgarrian (RCI) eta metilazioan oinarrituta (4C eta 5 irudiak). Hantura eta bakuoloen endekapena bezalako aldaketa edematosoak RCI eta metilazioen adierazleak dira, zitoplasman bakuolo erraldoi gisa agertzen direnak48,49. RCI-k energia-ekoizpenean eragiten du ATP ekoizpena murriztuz, ATPasa ponparen hutsegitea eraginez edo zelula-mintzak etenez eta Na+, Ca2+ eta uraren sarrera azkarra eraginez50,51,52. Bakuolo intrazitoplasmatikoak animalia-zeluletan sortzen dira Ca2+ eta uraren sarreraren ondorioz zitoplasman fluidoen metaketaren ondorioz53. Interesgarria da, zelulen kalteen mekanismo hau itzulgarria dela kaltea aldi baterakoa bada eta zelulek denbora-tarte jakin batez ATP ekoizten hasten badira, baina kaltea irauten badu edo okerrera egiten badu, zelulak hiltzen dira.54 Gure behaketek erakusten dute 5-iodoindolarekin tratatutako nematodoek ez dutela biosintesi normala berreskuratzen estres baldintzetan egon ondoren.
5-iodoindolak B. xylophilus-en eragindako metilazio fenotipoa iodoaren presentziaren eta haren banaketa molekularraren ondorio izan daiteke, 7-iodoindolak 5-iodoindolak baino efektu inhibitzaile txikiagoa izan baitzuen B. xylophilus-engan (1. taula eta S6 irudi osagarria). Emaitza hauek partzialki bat datoz Maltese et al.-en (2014) ikerketekin, zeinek jakinarazi zuten indoleko piridil nitrogeno zatiaren para- posiziotik meta- posiziorako translokazioak bakuolizazioa, hazkuntza inhibizioa eta zitotoxikotasuna ezabatzen zituela U251 zeluletan, eta horrek iradokitzen du molekulak proteinaren gune aktibo espezifiko batekin duen elkarrekintza kritikoa dela27,44,45. Ikerketa honetan behatutako indolaren edo indol halogenatuen eta GluCL hartzaileen arteko elkarrekintzek ere ideia hau babesten dute, 5- eta 2-iodoindolak aztertutako beste indolek baino indartsuago lotzen baitziren GluCL hartzaileetara (6. irudia eta S8 irudi osagarria). Indolaren bigarren edo bosgarren posizioan dagoen iodoa GluCL hartzailearen leuzina 218ri lotzen zaiola ikusi da bizkarrezurreko hidrogeno loturen bidez, beste indol halogenatu batzuek eta indolak berak, berriz, alboko kate hidrogeno lotura ahulak eratzen dituzte serina 260rekin (6. irudia). Beraz, espekulatzen dugu halogenoaren lokalizazioak zeregin garrantzitsua duela bakuoloaren endekapenaren indukzioan, eta 5-iodoindolaren lotura estuak ioi kanala irekita mantentzen duela, eta horrela fluidoen sarrera azkarra eta bakuoloaren haustura ahalbidetzen dituela. Hala ere, 5-iodoindolaren ekintza-mekanismo zehatza zehaztu gabe dago oraindik.
5-iodoindolaren aplikazio praktikoa egin aurretik, landareengan duen eragin toxikoa aztertu beharko litzateke. Gure hazien ernetze esperimentuek erakutsi zuten 5-iodoindolak ez zuela eragin negatiborik hazien ernetzean edo ondorengo garapen prozesuetan aztertutako kontzentrazioetan (7. irudia). Beraz, ikerketa honek oinarri bat eskaintzen du 5-iodoindola ingurune ekologikoan erabiltzeko, pinu nematodoek pinudientzat duten kaltegarritasuna kontrolatzeko.
Aurreko txostenek frogatu dute indolean oinarritutako terapiak antibiotikoen erresistentziaren eta minbiziaren progresioaren arazoa konpontzeko ikuspegi potentziala dela55. Horrez gain, indolek jarduera antibakterianoak, minbiziaren aurkakoak, antioxidatzaileak, hanturaren aurkakoak, diabetesaren aurkakoak, birusen aurkakoak, proliferazioaren aurkakoak eta tuberkulosiaren aurkakoak dituzte, eta oinarri itxaropentsua izan daitezke sendagaiak garatzeko56,57. Ikerketa honek lehen aldiz iradokitzen du iodoa agente antiparasitario eta antihelmintiko gisa erabil daitekeela.
Avermektina duela hiru hamarkada aurkitu zen eta 2015ean Nobel saria irabazi zuen, eta oraindik ere antihelmintiko gisa erabiltzen da. Hala ere, nematodoetan eta intsektu izurriteetan avermektinekiko erresistentzia azkar garatzen ari denez, estrategia alternatibo, merkea eta ingurumena errespetatzen duena behar da pinuetan PWN infekzioa kontrolatzeko. Ikerketa honek 5-iodoindolak pinu nematodoak hiltzeko mekanismoa ere azaltzen du, eta 5-iodoindolak landare-zelulentzat toxikotasun txikia duela, eta horrek etorkizuneko aplikazio komertzialetarako aukera onak irekitzen ditu.
Esperimentu guztiak Yeungnam Unibertsitateko (Gyeongsan, Korea) Etika Batzordeak onartu zituen, eta metodoak Yeungnam Unibertsitateko Etika Batzordearen jarraibideen arabera egin ziren.
Arrautzen inkubazio-esperimentuak prozedura finkatuak erabiliz egin ziren43. Eklosio-tasak (HR) ebaluatzeko, egun bateko nematodo helduak (gutxi gorabehera 100 eme eta 100 ar) onddoa zuten Petri plaketara eraman eta 24 orduz hazten utzi ziren. Ondoren, arrautzak isolatu eta 5-iodoindolarekin (0,05 mM eta 0,1 mM) edo avermektinarekin (10 μg/ml) tratatu ziren ur destilatu esterilean esekidura gisa. Esekidura hauek (500 μl; gutxi gorabehera 100 arrautza) 24 putzuko ehunen kultura-plaka baten putzuetara eraman eta 22 °C-tan inkubatu ziren. L2 zenbaketak 24 orduko inkubazioaren ondoren egin ziren, baina hilda kontsideratzen ziren zelulak platinozko hari fin batekin estimulatzean mugitzen ez baziren. Esperimentu hau bi etapatan egin zen, bakoitza sei errepikapenekin. Bi esperimentuetako datuak konbinatu eta aurkeztu ziren. HR-ren ehunekoa honela kalkulatzen da:
Larben hilkortasuna aurretik garatutako prozedurak erabiliz ebaluatu zen. Nematodoen arrautzak bildu ziren eta enbrioiak ur destilatu esterilean eklosioa eginez sinkronizatu ziren L2 faseko larbak sortzeko. Sinkronizatutako larbak (gutxi gorabehera 500 nematodo) 5-iodoindolarekin (0,05 mM eta 0,1 mM) edo avermektinarekin (10 μg/ml) tratatu ziren eta B. cinerea Petri plaketan hazi ziren. 22 °C-tan 48 orduko inkubazioaren ondoren, nematodoak ur destilatu esterilean bildu eta L2, L3 eta L4 faseen presentzia aztertu zen. L3 eta L4 faseen presentziak larben eraldaketa adierazi zuen, eta L2 fasearen presentziak, berriz, eraldaketarik ez. Irudiak iRiS™ Digital Cell Imaging System erabiliz eskuratu ziren. Esperimentu hau bi fasetan egin zen, bakoitza sei errepikapenekin. Bi esperimentuetako datuak konbinatu eta aurkeztu ziren.
5-iodoindolaren eta avermektinaren hazien toxikotasuna Murashige eta Skoog agar plaketan egindako ernetze-probak erabiliz ebaluatu zen. B. oleracea eta R. raphanistrum62 hazi lehenik ur destilatu esterilean busti ziren egun batez, % 100eko etanolarekin garbitu ziren, % 100eko lixiba komertzialarekin (% 3 sodio hipokloritoa) esterilizatu ziren 15 minutuz, eta bost aldiz garbitu ziren ml 1 ur esterilarekin. Ondoren, esterilizatutako haziak ernetze-agar plaketan sartu ziren, 0,86 g/l (0,2X) Murashige eta Skoog medioa eta % 0,7ko agar bakteriologikoa zituztenak, 5-iodoindol edo avermektinarekin edo gabe. Ondoren, plakak 22 °C-tan inkubatu ziren, eta irudiak 3 eguneko inkubazioaren ondoren hartu ziren. Esperimentu hau bi etapatan egin zen, eta bakoitzak sei errepikapen zituen.
Argitaratze data: 2025eko otsailaren 26a