Pinuaren nematodoa berrogeialdiko endoparasito migratzaile bat da, pinudietako ekosistemetan galera ekonomiko larriak eragiten dituela. Ikerketa honek indolo halogenatuen jarduera nematizida pinuaren nematodoen aurka eta haien ekintza-mekanismoa berrikusten ditu. Pinuaren nematodoen aurkako 5-iodoindolaren eta avermektinaren (kontrol positiboa) jarduera nematizidak antzekoak eta altuak izan ziren kontzentrazio baxuetan (10 μg/mL). 5-iodoindolak ugalkortasuna, ugalketa-jarduera, enbrioi- eta larben hilkortasuna eta lokomozio-jokaera murriztu zituen. Ornogabeen glutamatoaren araberako kloruro-kanalaren errezeptoreekin duten ligandoen interakzio molekularrek 5-iodoindola, avermektina bezala, hartzaileen gune aktiboarekin estu lotzen dela onartzen dute. 5-Iodoindolak hainbat deformazio fenotipiko ere eragin zituen nematodoetan, organoen kolapso/txikidura anormala eta vakuolizazioa areagotzea barne. Emaitza hauek iradokitzen dute bakuoloek nematodoen metilazio bidezko heriotzan izan dezaketela zeregina. Garrantzitsuena, 5-iodoindola ez zen toxikoa bi landare-espezieentzat (aza eta errefautxoentzat). Beraz, ikerketa honek frogatzen du iodoindolaren aplikazioak ingurumen-baldintzetan pinuaren zimelaren lesioa kontrola dezakeela.
Pinu-egurraren nematodoa (Bursaphelenchus xylophilus) pinu-egurraren nematodoei (PWN) dagokie, pinudietako ekosistemetan kalte ekologiko larriak eragiten dituzten nematodo endoparasito migratzaileak1. Pinu-zurraren nematodoak eragindako pinuaren zimelaren gaixotasuna (PWD) arazo larri bilakatzen ari da hainbat kontinentetan, Asian eta Europan barne, eta Ipar Amerikan, nematodoak sartutako pinu espezieak suntsitzen ditu1,2. Pinuen gainbehera arazo ekonomiko handia da, eta mundu mailan zabaltzeko aukera kezkagarria da3. Nematodoak honako pinu espezie hauei erasotzen die gehien: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii eta Pinus radiata4. Pinuaren nematodoa gaixotasun larria da, infekziotik aste edo hilabeteetan pinuak hil ditzakeena. Gainera, pinuaren nematodoen agerraldiak ohikoak dira hainbat ekosistematan, beraz, infekzio-kate iraunkorrak ezarri dira1.
Bursaphelenchus xylophilus Aphelenchoidea superfamiliako eta 102.5 kladoko berrogeialdiko landare-parasito-nematodoa da. Nematodoa onddoez elikatzen da eta pinuen egur-ehunetan ugaltzen da, lau larba fase ezberdinetan garatuz: L1, L2, L3, L4 eta banako heldu bat1,6. Elikagaien eskasiaren baldintzetan, pinuaren nematodoa larba-etapa espezializatu batera igarotzen da -dauer, bere bektorea parasitatzen duena - pinu-azala kakalardoa (Monochamus alternatus) eta pinudi osasuntsuetara eramaten da. Ostalari osasuntsuetan, nematodoek landare-ehunen bidez azkar migratzen dute eta zelula parenkimatosoez elikatzen dira, eta horrek hipersentsibilitate-erreakzio ugari eragiten ditu, pinua zimeltzea eta heriotza infekzioaren ondoren urtebeteko epean1,7,8.
Pinuaren nematodoen kontrol biologikoa erronka bat da aspalditik, berrogeialdi neurriak XX. Pinuaren nematodoak kontrolatzeko egungo estrategiek tratamendu kimikoak hartzen dituzte batez ere, egur-fumigazioa eta zuhaitz-enborretan nematizidak ezartzea barne. Gehien erabiltzen diren nematizidak avermektina eta avermektina benzoatoa dira, avermektina familiakoak. Produktu kimiko garesti hauek oso eraginkorrak dira nematodo-espezie askoren aurka eta ingurumenerako segurutzat jotzen dira9. Hala ere, nematizida hauek behin eta berriz erabiltzeak hautespen-presioa sortuko duela espero da, pinu-nematodo erresistenteak agertzea eragingo duena, hainbat intsektu-izurriterentzat frogatu den bezala, hala nola Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella eta Trichostrongylus colubylus colub eta Ostertagia circumcincta nematodoak, pixkanaka-pixkanaka, avermeriformisekiko erresistentzia garatu dutenak10,1111. Hori dela eta, erresistentzia-ereduak aldian-aldian aztertu eta nematizidak etengabe aztertu behar dira, PVD kontrolatzeko neurri alternatiboak, errentagarriak eta ingurumena errespetatzen dutenak aurkitzeko. Azken hamarkadetan, hainbat autorek landare-estraktuak, olio esentzialak eta lurrunkorrak nematodoak kontrolatzeko agente gisa erabiltzea proposatu dute13,14,15,16.
Duela gutxi Caenorhabditis elegans-en 17 indolaren, zelulen arteko eta erreinuen arteko seinaleztapen molekula baten jarduera nematizida frogatu dugu. Indola mikrobioen ekologian zelula barneko seinale hedatua da, mikrobioen fisiologian, esporen eraketan, plasmidoen egonkortasunean, botiken erresistentzian, biofilmen eraketa eta birulentzian eragina duten funtzio ugari kontrolatzen ditu 18, 19 . Ez da aztertu indolaren eta bere deribatuen jarduera beste nematodo patogeno batzuen aurka. Azterketa honetan, 34 indolen jarduera nematida ikertu dugu pinu nematodoen aurka eta 5-iodoindole indartsuenaren ekintza-mekanismoa argitu dugu mikroskopia, time-lapse argazkilaritza eta molekulako atrakatze-esperimentuak erabiliz, eta landareetan dituen efektu toxikoak ebaluatu ditugu haziak ernetzeko saiakuntza baten bidez.
Indolaren kontzentrazio handiek (>1,0 mM) aurretik nematodoetan eragin nematizida dutela jakinarazi dute17. B. xylophilus-en (bizitza-etapa mistoak) indolarekin edo 33 indol deribatu ezberdinekin 1 mM-tan tratatu ondoren, B. xylophilus-en hilkortasuna kontroleko eta tratatutako taldeetako nematodo biziak eta hilak zenbatuta neurtu zen. Bost indolek jarduera nematizida nabarmena erakutsi zuten; tratatu gabeko kontrol taldearen biziraupena 95 ± % 7koa izan zen 24 ordu igaro ondoren. Probatu diren 34 indoletatik, 5-iodoindol eta 4-fluoroindole 1 mM-tan % 100eko heriotza eragin zuten, 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboxilato eta 7-iodoindol-ek hilkortasuna gutxi gorabehera % 50 eragin zuten (1. taula).
5-iodoindolaren eragina pinu-egurrezko nematodoaren bakuoloen eraketan eta metabolismoan. (A) Avermektina eta 5-iodoindolaren eragina nematodo ar helduengan, (B) L1 estadioko nematodoen arrautzak eta (C) B. xylophilus-en metabolismoa, (i) ez ziren bakuoloak ikusi 0 ordutan, tratamenduak (ii) bakuoloak, (iii) bakuolo anitzen metaketa, (iv) bakuoloen hantura, (v) bakuoloen fusioa eta (vi) bakuolo erraldoien eraketa eragin zituen. Gezi gorriek bakuoloen hantura adierazten dute, gezi urdinek bakuoloen fusioa eta gezi beltzek bakuolo erraldoiak. Eskala-barra = 50 μm.
Horrez gain, ikerketa honek metanoak eragindako heriotzaren prozesu sekuentziala deskribatu du pinu nematodoetan (4C irudia). Heriotza metanogenikoa zelula-heriotza ez-apoptotikoa da, bakuolo zitoplasmatiko nabarmenen metaketarekin lotutakoa27. Pinuaren nematodoetan ikusitako akats morfologikoak oso lotuta daudela dirudi metanoak eragindako heriotzaren mekanismoarekin. Momentu ezberdinetan egindako azterketa mikroskopikoak erakutsi zuen 5-iodoindolarekin (0,1 mM) 20 h igaro ondoren bakuolo erraldoiak sortu zirela. Tratamenduaren 8 orduren ondoren bakuolo mikroskopikoak ikusi ziren, eta haien kopurua handitu egin zen 12 ordura. 14 orduren buruan hainbat bakuolo handi ikusi ziren. Hainbat bakuolo fusionatu garbi ikusten ziren tratamenduaren 12-16 orduren ondoren, eta horrek adierazten zuen bakuoloen fusioa heriotza metanogenikoaren mekanismoaren oinarria dela. 20 ordu igaro ondoren, hainbat bakuolo erraldoi aurkitu ziren harra osoan. Behaketa hauek C. elegans-en metuosiaren lehen txostena adierazten dute.
5-iodoindolarekin tratatutako zizareetan, bakuoloen agregazioa eta haustura ere ikusi ziren (5. irud.), zizareak tolestu eta ingurunera bakuoloak askatzeak erakusten duenez. Arrautza-oskolaren mintzean bakuolo-haustura ere ikusi zen, normalean L2-k oso-osorik mantentzen duen eklosioan (S2 irudi osagarria). Behaketa hauek fluidoen metaketa eta porrot osmoerregulatzailearen inplikazioa onartzen dute, baita zelulen lesio itzulgarria (RCI), bakuoloen eraketa eta supurazio prozesuan (5. irudia).
Behatutako bakuoloen eraketan iodoaren papera hipotezatuz, sodio ioduroaren (NaI) eta potasio ioduroaren (KI) jarduera nematicida ikertu genuen. Hala ere, kontzentrazioetan (0,1, 0,5 edo 1 mM), ez dute eraginik ez nematodoen biziraupenean ez bakuoloen sorreran (S5 irudi osagarria), nahiz eta 1 mM KI-k efektu nematizida apur bat izan. Bestalde, 7-iodoindolak (1 edo 2 mM), 5-iodoindolak bezala, bakuolo anitz eta deformazio estrukturalak eragin zituen (S6 irudi osagarria). Bi iodoindoloek antzeko ezaugarri fenotipikoak erakutsi zituzten pinuaren nematodoetan, NaI eta KI-k, aldiz, ez. Interesgarria da indolak ez zuen B. xylophilus-en bakuoloen sorrera eragin probatutako kontzentrazioetan (datuak ez dira erakusten). Hala, emaitzek baieztatu zuten indol-iodo konplexua dela B. xylophilus-en vakuolizazioaren eta metabolismoaren arduraduna.
Jarduera nematizidarako probatutako indolen artean, 5-iodoindolak -5,89 kcal/mol-eko irristatze-indize altuena izan zuen, 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) eta indol (-4,03) ondoren (6. irudia). 5-iodoindolaren hidrogeno-lotura sendoak leuzina 218-rekin duen lotura egonkortzen du, beste indol deribatu guztiak 260 serinarekin lotzen diren albo-katearen hidrogeno-loturen bidez. Modelatutako beste iodoindoleen artean, 2-iodoindolak -5,248 kcal/mol-eko lotura-balioa du, hau da, 218 leuzinarekin duen hidrogeno-lotura nagusiaren ondorioz. Beste lotura ezagun batzuk 3-iodoindole (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4,0 kcal/mol/mol) eta kcal/mol. (S8 irudi osagarria). Indolo halogenatu gehienek eta indoloak berak, 5-iodoindole eta 2-iodoindole izan ezik, 260 serinarekin lotura bat osatzen dute. Leuzina 218-rekin hidrogeno-loturak hartzaile-ligando-lotura eraginkorren adierazgarri izateak, ivermektinan ikusi den bezala (S7 eta S7 eta 2. irudi osagarriak), baieztatzen du. ivermektina, estu lotzen da GluCL hartzailearen gune aktibora 218 leucinearen bidez (6. irudia eta S8. irudi osagarria). Lotura hori GluCL konplexuaren poro irekiaren egitura mantentzeko beharrezkoa dela proposatzen dugu eta GluCL hartzailearen gune aktiboari estuki lotuz, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectina eta ivermectina, horrela, kanal ioikoa irekita mantentzen dute eta fluidoen harrapaketa ahalbidetzen dute.
Indolaren eta indol halogenatuaren atrakatze molekularra GluCL-ra. (A) indol, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole eta (D) 5-iodoindole ligandoen GluCL gune aktibora lotzeko orientazioak. Proteina zinta baten bidez irudikatzen da, eta bizkarrezurreko hidrogeno-loturak puntu horizko marra gisa erakusten dira. (A′), (B′), (C′) eta (D′) dagozkien ligandoek inguruko aminoazido-hondakinekin duten elkarreraginak erakusten dituzte, eta alboko katearen hidrogeno-loturak puntu arrosazko gezien bidez adierazten dira.
5-iodoindolak aza eta errefau hazien ernetzean duen efektu toxikoa ebaluatzeko esperimentuak egin ziren. 5-iodoindolak (0,05 edo 0,1 mM) edo avermektinak (10 μg/mL) hasierako ernekuntzan eta plantulen sorreran eragin txikia edo bat ere izan zuten (7. irudia). Horrez gain, ez zen desberdintasun esanguratsurik aurkitu tratatu gabeko kontrolen eta 5-iodoindolarekin edo avermektinarekin tratatutako hazien ernetze-tasaren artean. Taroot-en luzapenean eta eratutako alboko sustrai kopuruan eragina hutsala izan zen, nahiz eta 1 mM (10 aldiz bere kontzentrazio aktiboa) 5-iodoindolaren alboko sustraien garapena apur bat atzeratu zuen. Emaitza hauek adierazten dute 5-iodoindola ez dela toxikoa landare-zelulentzat eta ez duela oztopatzen landareen garapen-prozesuetan aztertutako kontzentrazioetan.
5-iodoindolaren eragina hazien ernetzean. B. oleracea eta R. raphanistrum hazien ernetzea, kimatzea eta alboko errotzea Murashige eta Skoog agar-eremuan avermektina edo 5-iodoindolarekin edo gabe. Germinazioa 3 egunetan 22 °C-tan inkubatu ondoren erregistratu zen.
Azterketa honek indolen bidez nematodoak hildako hainbat kasuren berri ematen du. Garrantzitsuena, hau da iodoindolaren metilazioa (pixkanaka bakuolo erraldoietan batzen diren bakuolo txikien metaketaren ondorioz sortutako prozesu bat, azkenean mintza haustura eta heriotza ekarriz) pinu-orratzetan, iodoindolak nematicida komertzialen avermektinaren antzeko propietate nematizida garrantzitsuak erakusten dituena.
Indolek prokariotoetan eta eukariotoetan seinaleztapen-funtzio anitz betetzen dituztela jakinarazi dute, besteak beste, biofilmen inhibizioa/eraketa, bakterioen biziraupena eta patogenikotasuna19,32,33,34. Berriki, indol halogenatuen, indol alkaloideen eta indol deribatu erdisintetikoen efektu terapeutiko potentzialek ikerketa-interes handia erakarri dute35,36,37. Adibidez, indolo halogenatuak Escherichia coli eta Staphylococcus aureus zelula iraunkorrak hiltzen dituela frogatu da37. Horrez gain, interes zientifikoa da indolo halogenatuen eraginkortasuna aztertzea beste espezie, genero eta erreinuen aurrean, eta ikerketa hau helburu hori lortzeko urrats bat da.
Hemen, C. elegans-en 5-iodoindolak eragindako hilkortasunerako mekanismo bat proposatzen dugu, zelula-lesio itzulgarrian (RCI) eta metilazioan oinarrituta (4C eta 5. irudiak). Aldaketa edematosoa, esate baterako, puztasuna eta endekapen bakuolarra, RCI eta metilazioen adierazleak dira, zitoplasman bakuolo erraldoi gisa agertzen direnak48,49. RCI-k energia-ekoizpena oztopatzen du ATP ekoizpena murriztuz, ATPasaren ponparen porrota eraginez edo zelulen mintzak apurtuz eta Na+, Ca2+ eta uraren sarrera azkarra eraginez50,51,52. Animalien zeluletan bakuolo intrazitoplasmatikoak zitoplasman likido metaketaren ondorioz sortzen dira Ca2+ eta uraren sarreraren ondorioz53. Interesgarria da zelulen kalte-mekanismo hori itzulgarria dela kaltea aldi baterako bada eta zelulak denbora-tarte jakin batean ATP sortzen hasten badira, baina kalteak iraun edo okerrera egiten badu, zelulak hil egiten dira.54 Gure behaketek erakusten dute 5-iodoindolarekin tratatutako nematodoek ezin dutela biosintesi normala berreskuratu estres-baldintzak jasan ondoren.
B. xylophilus-en 5-iodoindolak eragindako metilazio-fenotipoa iodoaren presentziaren eta bere banaketa molekularrengatik izan daiteke, 7-iodoindolak B. xylophilus-en 5-iodoindolak baino eragin inhibitzaile gutxiago izan baitzuen (1. taula eta S6 irudi osagarria). Emaitza hauek partzialki bat datoz Maltese et al-en ikerketekin. (2014), indolean piridil nitrogeno zatia para-posiziotik meta-posiziora igarotzeak U251 zeluletan vakuolizazioa, hazkuntza inhibizioa eta zitotoxikotasuna deuseztatu zituela jakinarazi zuen, molekulak proteinaren gune aktibo zehatz batekin elkarrekintza kritikoa dela iradokiz27,44,45. Ikerketa honetan ikusitako indol edo indolo halogenatuen eta GluCL errezeptoreen arteko elkarrekintzek ere onartzen dute nozio hori, izan ere, 5- eta 2-iodoindoloak GluCL hartzaileei aztertutako beste indoloak baino indartsuago lotzen zirela aurkitu baitzen (6. irudia eta S8 irudi osagarria). Indolaren bigarren edo bosgarren posizioan dagoen iodoa GluCL errezeptorearen 218 leuzina lotzen zela aurkitu zen bizkarrezurreko hidrogeno-loturen bidez, eta beste indolo halogenatu batzuek eta indolak berak albo-katearen hidrogeno-lotura ahulak osatzen dituzte 260 serinarekin (6. irudia). Beraz, espekulatzen dugu halogenoaren lokalizazioak paper garrantzitsua betetzen duela endekapen bakuolarraren indukzioan, 5-iodoindolaren lotura estuak ioi-kanala irekita mantentzen duelarik, eta horrela fluido-fluxu azkarra eta bakuolo-haustura ahalbidetzen du. Hala ere, 5-iodoindolaren ekintza-mekanismo zehatza zehazteko dago.
5-iodoindolaren aplikazio praktikoa baino lehen, landareetan duen eragin toxikoa aztertu behar da. Gure haziak ernetzeko esperimentuek erakutsi zuten 5-iodoindolak ez zuela eragin negatiborik izan aztertutako kontzentrazioetan hazien ernekuntzan edo ondorengo garapen prozesuetan (7. Irudia). Horrela, ikerketa honek 5-iodoindola ingurune ekologikoan erabiltzeko oinarri bat eskaintzen du pinuen nematodoek pinuentzat duten kaltegarritasuna kontrolatzeko.
Aurreko txostenek frogatu dute indolean oinarritutako terapia antibiotikoen erresistentziaren eta minbiziaren progresioaren arazoari aurre egiteko planteamendu potentziala dela55. Horrez gain, indolek bakterioen, minbiziaren aurkako, antioxidatzaile, antiinflamatorio, antidiabetiko, birusen, antiproliferatibo eta tuberkulosiaren aurkako jarduerak dituzte eta drogak garatzeko oinarri itxaropentsu gisa balio dezakete56,57. Ikerketa honek iodoaren balizko erabilera iradokitzen du lehen aldiz parasito eta antihelmintiko agente gisa.
Duela hiru hamarkada aurkitu zuten avermectina eta 2015ean Nobel Saria irabazi zuen, eta bere erabilera antihelmintiko gisa aktiboki jarraitzen du. Hala ere, nematodoetan eta intsektu-izurriteetan avermektinekiko erresistentzia azkar garatzen denez, estrategia alternatibo bat, kostu baxuko eta ingurumena errespetatzen duen estrategia bat behar da pinudietan PWN infekzioa kontrolatzeko. Ikerketa honek 5-iodoindolak pinu nematodoak hiltzen dituen mekanismoaren berri ematen du eta 5-iodoindolak landare-zelulentzat toxikotasun txikia duela, eta horrek etorkizuneko merkataritza-aplikaziorako aukera onak zabaltzen ditu.
Esperimentu guztiak Yeungnam Unibertsitateko, Gyeongsan, Koreako Etika Batzordeak onartu zituen eta metodoak Yeungnam Unibertsitateko Etika Batzordearen jarraibideen arabera egin ziren.
Arrautzak inkubatzeko esperimentuak ezarri ziren prozedurak erabiliz43. Eklosio-tasak (HR) ebaluatzeko, egun bateko nematodo helduak (gutxi gorabehera 100 eme eta 100 ar) onddoa zuten Petri plaketara transferitu ziren eta 24 orduz hazten utzi ziren. Ondoren, arrautzak isolatu eta 5-iodoindole (0,05 mM eta 0,1 mM) edo avermektina (10 μg/ml) ur distilatu antzuetan esekidura gisa tratatu ziren. Suspentsio hauek (500 μl; gutxi gorabehera 100 arrautza) 24 putzuko ehun-kultur plaka baten putzuetara transferitu eta 22 °C-tan inkubatu ziren. L2 zenbaketak inkubazioaren 24 orduren ondoren egin ziren, baina hildakotzat jotzen ziren zelulak ez baziren mugitzen platinozko hari fin batekin estimulatuta. Esperimentu hau bi fasetan egin zen, bakoitza sei errepikapenekin. Bi esperimentuetako datuak konbinatu eta aurkeztu ziren. HRaren ehunekoa honela kalkulatzen da:
Larben hilkortasuna aldez aurretik garatutako prozedurak erabiliz ebaluatu zen. Nematodoen arrautzak bildu eta enbrioiak sinkronizatu ziren ur distilatu antzuan eklosioan L2 faseko larbak sortzeko. Sinkronizatutako larbak (500 nematodo inguru) 5-iodoindolarekin (0,05 mM eta 0,1 mM) edo avermektinarekin (10 μg/ml) tratatu eta B. cinerea Petri plaketan hazi ziren. 22 °C-tan inkubatzeko 48 ordu igaro ondoren, nematodoak ur distilatu antzuetan bildu eta L2, L3 eta L4 faseen presentzia aztertu zuten. L3 eta L4 faseak egoteak larben eraldaketa adierazten zuen, L2 faseak, berriz, eraldaketarik ez. Irudiak iRiS™ Digital Cell Imaging System erabiliz eskuratu ziren. Esperimentu hau bi fasetan egin zen, bakoitza sei errepikapenekin. Bi esperimentuetako datuak konbinatu eta aurkeztu ziren.
5-iodoindolaren eta avermektinaren haziekiko toxikotasuna Murashige eta Skoog agar-plaketan ernetze-probak erabiliz ebaluatu zen.62 B. oleracea eta R. raphanistrum haziak ur distilatu antzuetan busti ziren egun batez, 1 ml 100% etanolarekin garbitu (%50 etanol komertzialarekin, %50 esterilizatuz). hipokloritoa) 15 minutuz, eta bost aldiz garbitu 1 ml ur antzuarekin. Ondoren, esterilizatutako haziak 0,86 g/l (0,2X) Murashige eta Skoog medio eta % 0,7 agar bakteriologikoa 5-iodoindol edo avermectina duten ernetze-agar plaketan sakatu dira. Ondoren, plakak 22 °C-tan inkubatu ziren, eta 3 eguneko inkubazioaren ondoren irudiak hartu ziren. Esperimentu hau bi fasetan egin zen, eta horietako bakoitzak sei errepikapen izan zituen.
Argitalpenaren ordua: 2025-Otsailaren 26a