Ikerketa honek produktu komertzialen hilkortasuna, subletalitatea eta toxikotasuna ebaluatu zituen.zipermetrinaanuro zapaburuei egindako formulazioak. Proba akutuan, 100-800 μg/L-ko kontzentrazioak probatu ziren 96 orduz. Proba kronikoan, zipermetrina naturalaren kontzentrazioak (1, 3, 6 eta 20 μg/L) hilkortasunaren probatu ziren, eta ondoren mikronukleoen probak eta globulu gorrien nukleo-anomaliak egin ziren 7 egunez. Zipermetrina formulazio komertzialaren LC50 zapaburuei egindakoa 273,41 μg L−1 izan zen. Proba kronikoan, kontzentrazio altuenak (20 μg L−1) % 50 baino gehiagoko hilkortasuna eragin zuen, probatutako zapaburuen erdia hil baitzuen. Mikronukleoen probak emaitza esanguratsuak erakutsi zituen 6 eta 20 μg L−1-tan eta hainbat nukleo-anomalia detektatu ziren, eta horrek adierazten du zipermetrina formulazio komertzialak P. gracilis-en aurkako potentzial genotoxikoa duela. Zipermetrina arrisku handia da espezie honetarako, eta horrek adierazten du arazo ugari sor ditzakeela eta ekosistema honen dinamikan eragina izan dezakeela epe laburrean eta luzean. Beraz, ondoriozta daiteke zipermetrina formulazio komertzialek eragin toxikoak dituztela P. gracilis-engan.
Nekazaritza-jardueren etengabeko hedapenaren eta aplikazio intentsiboaren ondorioz,izurriteen kontrolaneurriei dagokienez, uretako animaliak maiz egoten dira pestiziden eraginpean1,2. Nekazaritza-soroetatik gertu dauden ur-baliabideen kutsadurak anfibioen moduko helburu ez diren organismoen garapenean eta biziraupenean eragina izan dezake.
Anfibioak gero eta garrantzitsuagoak bihurtzen ari dira ingurumen-matrizeen ebaluazioan. Anuroak ingurumen-kutsatzaileen bioadierazle onak direla uste da, bizi-ziklo konplexuak, larben hazkunde-tasa azkarrak, egoera trofikoa, azal iragazkorra10,11, ugaltzeko urarekiko menpekotasuna12 eta arrautza babestu gabeak11,13,14 bezalako ezaugarri bereziak dituztelako. Ur-igel txikia (Physalaemus gracilis), negar-igel izenez ezagutzen dena, pestiziden kutsaduraren bioadierazle espeziea dela frogatu da4,5,6,7,15. Espeziea ur geldietan, babestutako eremuetan edo habitat aldakorreko eremuetan aurkitzen da Argentinan, Uruguain, Paraguain eta Brasilen1617, eta IUCN sailkapenak egonkortzat jotzen du, banaketa zabala eta habitat desberdinekiko tolerantzia duelako18.
Zipermetrinaren eraginpean egon ondoren anfibioetan efektu subhilgarriak jakinarazi dira, besteak beste, zapaburuen portaera-, morfologia- eta biokimika-aldaketak23,24,25, hilkortasun- eta metamorfosi-denboraren aldaketa, aldaketa entzimatikoak, eklosio-arrakasta gutxitzea24,25, hiperaktibitatea26, kolinesterasa-jardueraren inhibizioa27 eta igeriketa-errendimenduan izandako aldaketak7,28. Hala ere, zipermetrinak anfibioetan dituen efektu genotoxikoei buruzko ikerketak mugatuak dira. Hori dela eta, garrantzitsua da anuro espezieek zipermetrinarekiko duten sentikortasuna ebaluatzea.
Ingurumen-kutsadurak anfibioen hazkuntza eta garapen normalean eragiten du, baina albo-ondorio larriena pestiziden eraginpean egoteak DNAri eragindako kalte genetikoa da13. Odol-zelulen morfologiaren analisia kutsaduraren eta substantzia batek espezie basatiengan duen toxikotasun potentzialaren bioadierazle garrantzitsua da29. Mikronukleoen testa ingurumenean dauden produktu kimikoen genotoxikotasuna zehazteko metodorik erabilienetako bat da30. Metodo azkarra, eraginkorra eta merkea da, anfibioen moduko organismoen kutsadura kimikoaren adierazle ona dena31,32 eta kutsatzaile genotoxikoen esposizioari buruzko informazioa eman dezakeena33.
Ikerketa honen helburua zipermetrina formulazio komertzialek uretako zapaburu txikientzat duten potentzial toxikoa ebaluatzea izan zen, mikronukleoen proba eta arrisku ekologikoaren ebaluazioa erabiliz.
Probaren aldi akutuan zipermetrina komertzialaren kontzentrazio desberdinen eraginpean egon ziren P. gracilis zapaburuen hilkortasun metatua (%).
Zipermetrina komertzialaren kontzentrazio desberdinen eraginpean egon diren P. gracilis zapaburuen hilkortasun metatua (%) proba kroniko batean zehar.
Behaketaren hilkortasun handia zipermetrina-kontzentrazio desberdinen (6 eta 20 μg/L) eraginpean zeuden anfibioetan izandako efektu genotoxikoen ondorio izan zen, mikronukleoen (MN) presentziak eta eritrozitoetan dauden anomalia nuklearrek frogatzen duten bezala. MNren eraketak mitosian akatsak adierazten ditu eta kromosomen eta mikrotubuluekiko lotura eskasarekin, kromosomen xurgapen eta garraioaz arduratzen diren proteina-konplexuetako akatsekin, kromosomen segregazioan dauden akatsekin eta DNAren kalteen konponketan dauden akatsekin lotuta dago38,39 eta pestizidek eragindako estres oxidatiboarekin erlazionatuta egon daiteke40,41. Beste anomalia batzuk ere ikusi ziren ebaluatutako kontzentrazio guztietan. Zipermetrina-kontzentrazioak handitzeak eritrozitoetako anomalia nuklearrak % 5 eta % 20 handitu zituen dosi txikienetan (1 μg/L) eta handienetan (20 μg/L), hurrenez hurren. Adibidez, espezie baten DNAn izandako aldaketek ondorio larriak izan ditzakete epe laburrean eta luzean biziraupenean, populazioaren beherakada, ugalketa-egokitasunaren aldaketa, endogamia, aniztasun genetikoaren galera eta migrazio-tasen aldaketa eraginez. Faktore horiek guztiek eragina izan dezakete espezieen biziraupenean eta mantentzean42,43. Eritrozitoen agerpenak zitozinesian blokeoa egon daitekeela adieraz dezake, eta horrek zelula-zatiketa anormala eragin dezake (eritrozito binukleatuak)44,45; nukleo multilobulatuak mintz nuklearraren irtenguneak dira, lobulu anitzekin46, eta beste eritrozito-anomalia batzuk DNAren anplifikazioarekin lotuta egon daitezke, hala nola giltzurrun/anpulu nuklearrak47. Eritrozito anukleatuen presentziak oxigeno-garraio urria adieraz dezake, batez ere ur kutsatuetan48,49. Apoptosiak zelulen heriotza adierazten du50.
Beste ikerketa batzuek ere frogatu dituzte zipermetrinaren efektu genotoxikoak. Kabaña et al.51-ek mikronukleoen eta aldaketa nuklearren presentzia frogatu zuten, hala nola zelula binukleatuak eta zelula apoptotikoak, Odontophrynus americanus zeluletan zipermetrina kontzentrazio altuen eraginpean egon ondoren (5000 eta 10.000 μg L−1) 96 orduz. Zipermetrinak eragindako apoptosia ere detektatu zen P. biligonigerus52 eta Rhinella arenarum53-en. Emaitza hauek iradokitzen dute zipermetrinak efektu genotoxikoak dituela hainbat organismo akuatikotan eta MN eta ENA analisiak anfibioen gaineko efektu subletalei buruzko adierazle izan daitezkeela eta toxikoen eraginpean dauden bertako espezie eta populazio basatiengan aplikagarria izan daitekeela12.
Zipermetrinaren formulazio komertzialek ingurumen-arrisku handia dakarte (bai akutua bai kronikoa), eta HQ-ek AEBetako Ingurumen Babeserako Agentziaren (EPA) maila gainditzen dute54, eta horrek espezieari kalte egin diezaioke ingurumenean baldin badago. Arrisku kronikoaren ebaluazioan, hilkortasunerako NOEC 3 μg L−1 izan zen, eta horrek baieztatzen du uretan aurkitutako kontzentrazioek espeziearentzat arriskua izan dezaketela55. Endosulfan eta zipermetrinaren nahasketa bati esposizioa eman zioten R. arenarum larben NOEC hilgarria 500 μg L−1 izan zen 168 ordu igaro ondoren; balio hori 0,0005 μg L−1-ra jaitsi zen 336 ordu igaro ondoren. Egileek erakusten dute zenbat eta esposizio luzeagoa izan, orduan eta txikiagoak direla espeziearentzat kaltegarriak diren kontzentrazioak. Garrantzitsua da, halaber, azpimarratzea NOEC balioak P. gracilis-enak baino handiagoak izan zirela esposizio-denbora berean, eta horrek adierazten du espeziearen zipermetrinarekiko erantzuna espezie espezifikoa dela. Gainera, hilkortasunari dagokionez, P. gracilis-en CHQ balioa zipermetrinaren eraginpean egon ondoren 64,67ra iritsi zen, hau da, AEBetako Ingurumen Babeserako Agentziak54 ezarritako erreferentziazko balioa baino handiagoa, eta R. arenarum larben CHQ balioa ere balio hori baino handiagoa izan zen (CHQ > 388,00 336 ordu igaro ondoren), eta horrek adierazten du aztertutako intsektizidek arrisku handia dakartela hainbat anfibio espezierentzat. P. gracilis-ek metamorfosia osatzeko 30 egun inguru behar dituela kontuan hartuta56, ondoriozta daiteke aztertutako zipermetrinaren kontzentrazioek populazioaren beherakadan lagun dezaketela, kutsatutako banakoei helduaroan edo ugalketa-fasean sartzea eragotziz adin txikian.
Mikronukleoen eta eritrozitoen nukleoko beste anomalia batzuen arrisku-ebaluazio kalkulatuan, CHQ balioak 14,92tik 97,00era bitartekoak izan ziren, eta horrek adierazten du zipermetrinak arrisku genotoxiko potentziala zuela P. gracilisentzat, baita bere habitat naturalean ere. Hilkortasuna kontuan hartuta, P. gracilisentzat onargarria zen konposatu xenobiotikoen gehienezko kontzentrazioa 4,24 μg L−1 izan zen. Hala ere, 1 μg/L-ko kontzentrazioek ere efektu genotoxikoak erakutsi zituzten. Gertakari honek banako anormalen kopurua handitzea ekar dezake57 eta espezieen garapenean eta ugalketan eragina izan dezake beren habitatetan, anfibioen populazioen beherakada eraginez.
Zipermetrina intsektizidaren formulazio komertzialek toxikotasun akutua eta kronikoa erakutsi zuten P. gracilis-entzat. Hilkortasun-tasa handiagoak ikusi ziren, ziurrenik efektu toxikoengatik, mikronukleoen eta eritrozitoen nukleo-anomalien presentziak frogatzen duen bezala, batez ere nukleo zerratuak, nukleo lobulatuak eta nukleo besikularrak. Gainera, aztertutako espezieek ingurumen-arrisku handiagoak erakutsi zituzten, bai akutuak bai kronikoak. Datu hauek, gure ikerketa-taldeak egindako aurreko ikerketekin batera, erakutsi zuten zipermetrinaren formulazio komertzial desberdinek ere azetilkolinesterasa (AChE) eta butirilkolinesterasa (BChE) jarduera gutxitzea eta estres oxidatiboa58 eragiten zituztela, eta igeriketa-jardueran aldaketak eta ahoko malformazioak59 eragin zituztela P. gracilis-en, eta horrek adierazten du zipermetrinaren formulazio komertzialek toxikotasun hilgarri eta subhilgarri handia dutela espezie honentzat. Hartmann et al. 60 aurkitu zuten zipermetrinaren formulazio komertzialak zirela toxikoenak P. gracilis-entzat eta genero bereko beste espezie batentzat (P. cuvieri) beste bederatzi pestizidekin alderatuta. Horrek iradokitzen du ingurumena babesteko zipermetrinaren kontzentrazio legalki baimenduek hilkortasun handia eta epe luzeko populazioaren beherakada ekar ditzakeela.
Pestizidak anfibioentzat duen toxikotasuna ebaluatzeko ikerketa gehiago behar dira, ingurumenean aurkitzen diren kontzentrazioek hilkortasun handia eragin dezaketelako eta P. gracilis-entzat arrisku potentziala izan daitekeelako. Anfibio espezieei buruzko ikerketa sustatu beharko litzateke, organismo hauei buruzko datuak urriak baitira, batez ere Brasilgo espezieei buruzkoak.
Toxikotasun kronikoaren probak 168 ordu (7 egun) iraun zuen baldintza estatikoetan, eta kontzentrazio subletalak hauek izan ziren: 1, 3, 6 eta 20 μg ai L−1. Bi esperimentuetan, tratamendu-talde bakoitzeko 10 zapaburu ebaluatu ziren sei errepikapenekin, guztira 60 zapaburu kontzentrazio bakoitzeko. Bitartean, urarekin bakarrik egindako tratamendua kontrol negatibo gisa erabili zen. Esperimentu-muntaketa bakoitzak 500 ml-ko edukiera eta 50 ml-ko disoluzioko zapaburu 1eko dentsitatea zuen beirazko ontzi esteril bat zuen. Matrazea polietilenozko film batez estali zen lurruntzea saihesteko eta etengabe aireztatu zen.
Ura kimikoki aztertu zen pestiziden kontzentrazioak zehazteko 0, 96 eta 168 ordutan. Sabin et al. 68 eta Martins et al. 69-ren arabera, analisiak Santa Mariako Unibertsitate Federaleko Pestiziden Analisi Laborategian (LARP) egin ziren, gas kromatografia hirukoitz koadrupolo masa espektrometriarekin akoplatuta (Varian 1200 modeloa, Palo Alto, Kalifornia, AEB). Uretan pestiziden determinazio kuantitatiboa material osagarri gisa erakusten da (SM1 taula).
Mikronukleoen probarako (MNT) eta globulu gorrien nukleo-anomaliaren probarako (RNA), tratamendu-talde bakoitzeko 15 zapaburu aztertu ziren. Zapaburuak % 5eko lidokainarekin (50 mg g-170) anestesiatu ziren eta odol-laginak bihotz-puntzio bidez bildu ziren heparinizatutako xiringa botatzekoak erabiliz. Odol-frotisak mikroskopio-portaobjektu esteriletan prestatu ziren, airean lehortu, % 100eko metanolarekin (4 °C) finkatu 2 minutuz, eta ondoren % 10eko Giemsa disoluzioarekin tindatu 15 minutuz iluntasunean. Prozesuaren amaieran, portaobjektuak ur destilatuarekin garbitu ziren soberako orbana kentzeko eta giro-tenperaturan lehortu ziren.
Zapaburu bakoitzeko gutxienez 1000 eritrozito aztertu ziren 100× mikroskopio bat erabiliz, 71 objektiboarekin, MN eta ENAren presentzia zehazteko. Zapaburuetako guztira 75.796 eritrozito ebaluatu ziren, zipermetrina kontzentrazioak eta kontrolak kontuan hartuta. Genotoxikotasuna Carrasco et al. eta Fenech et al.-en metodoaren arabera aztertu zen38,72, ondorengo lesio nuklearren maiztasuna zehaztuz: (1) zelula anukleatuak: nukleorik gabeko zelulak; (2) zelula apoptotikoak: nukleoaren zatikatzea, zelula-heriotza programatua; (3) zelula binukleatuak: bi nukleo dituzten zelulak; (4) kimu nuklearrak edo puzte-zelulak: mintz nuklearraren irtengune txikiak dituzten nukleoak dituzten zelulak, mikronukleoen antzeko tamainako puzteak; (5) kariolizatutako zelulak: nukleoaren eskema bakarrik duten zelulak, barne-materialik gabe; (6) zelula koskadunak: pitzadura edo koska nabarmenak dituzten nukleoak dituzten zelulak, giltzurrun-formako nukleoak ere deituak; (7) zelula lobulatuak: aipatutako besikula baino handiagoak diren irtengune nuklearrak dituzten zelulak; eta (8) mikrozelulak: nukleo kondentsatua eta zitoplasma murriztua duten zelulak. Aldaketak kontrol negatiboen emaitzekin alderatu ziren.
Toxikotasun akutuaren proben emaitzak (LC50) GBasic softwarea eta TSK-Trimmed Spearman-Karber metodoa74 erabiliz aztertu ziren. Proba kronikoen datuak errore normaltasunaren (Shapiro-Wilks) eta bariantzaren homogeneotasunaren (Bartlett) aurretik probatu ziren. Emaitzak bariantzaren analisi unidirekzionala (ANOVA) erabiliz aztertu ziren. Tukey-ren testa erabili zen datuak elkarren artean alderatzeko, eta Dunnett-en testa tratamendu-taldearen eta kontrol negatiboko taldearen arteko datuak alderatzeko.
LOEC eta NOEC datuak Dunnett-en testa erabiliz aztertu ziren. Proba estatistikoak Statistica 8.0 softwarea (StatSoft) erabiliz egin ziren, % 95eko esangura-mailarekin (p < 0,05).
Argitaratze data: 2025eko martxoaren 13a