DELLA proteinak kontserbatzen dirahazkunde-erregulatzaileaklandareen garapenean funtsezko zeregina betetzen dutenak barne eta kanpo seinaleei erantzunez. Transkripzio-erreguladore gisa, DELLAk transkripzio-faktoreei (TF) eta H2A histonei lotzen zaizkie beren GRAS domeinuen bidez eta sustatzaileetan jarduteko errekrutatzen dira. Azken ikerketek erakutsi dute DELLAren egonkortasuna itzulpen osteko bi mekanismoren bidez erregulatzen dela: landare-hormonak eragindako poliubikitinazioagiberelina, eta horrek haien degradazio azkarra eta ubikitina-antzeko aldatzaile txiki batekin (SUMO) konjugazioa dakar, eta horrek haien metaketa handitzen du. Gainera, DELLA jarduera bi glikosilazio-mekanismo desberdinek erregulatzen dute dinamikoki: O-fukosilazioak DELLA-TF interakzioa hobetzen du, eta O-lotutako N-azetilglukosamina (O-GlcNAc) aldaketak DELLA-TF interakzioa inhibitzen du. Hala ere, DELLA fosforilazioaren eginkizuna ez dago argi, aurreko ikerketek emaitza kontrajarriak erakutsi baitituzte, batzuek fosforilazioak DELLA degradazioa sustatzen edo erreprimitzen duela iradokitzen baitute eta beste batzuek fosforilazioak ez duela haien egonkortasunean eragiten. Hemen, fosforilazio-guneak identifikatzen ditugu Arabidopsis thaliana-tik masa-espektrometria bidez purifikatutako GA1-3 errepresorean (RGA), AtDELLA-n, eta erakusten dugu bi RGA peptidoen fosforilazioak PolyS eta PolyS/T eskualdeetan RGA jarduera hobetzen duela H2A lotura eta RGA sustatzaileekin elkartzea sustatuz. Aipagarria da fosforilazioak ez zuela RGA-TF interakzioetan edo RGA egonkortasunean eragin. Gure ikerketak fosforilazioak DELLA jarduera eragiten duen mekanismo molekular bat agerian uzten du.
Gure masa-espektrometriako analisiak agerian utzi zuen Pep1 eta Pep2 oso fosforilatuta zeudela RGA-n, GA gabezia duen Ga1 atzeko planoan. Ikerketa honetaz gain, fosfoproteomikako ikerketek ere Pep1 fosforilazioa agerian utzi dute RGA-n, nahiz eta bere eginkizuna oraindik ez den aztertu53,54,55. Aitzitik, Pep2 fosforilazioa ez da lehenago deskribatu, peptido hau RGAGKG transgenea erabiliz bakarrik detektatu baitzen. m1A mutazioak, Pep1 fosforilazioa ezabatzen zuenak, RGA jarduera apur bat murriztu zuen plantan, baina efektu gehigarria izan zuen m2A-rekin konbinatuta RGA jarduera murrizteko (6. irudi osagarria). Garrantzitsua da, Pep1 fosforilazioa nabarmen murriztu zela GA-hobetutako sly1 mutantean ga1-ekin alderatuta, eta horrek iradokitzen du GA-k RGA desfosforilazioa sustatzen duela, bere jarduera murriztuz. GA-k RGA fosforilazioa murrizteko mekanismoak ikerketa gehiago behar ditu. Aukera bat da hau proteina kinasa identifikatu gabe baten erregulazioaren bidez lortzen dela. Ikerketek erakutsi duten arren CK1 proteina kinasa EL1-aren adierazpena GA-k beherantz erregulatzen duela arrozean41, gure emaitzek adierazten dute Arabidopsis EL1 homologoaren (AEL1-4) goi-mailako mutazioek ez dutela RGA fosforilazioa murrizten. Gure emaitzekin bat etorriz, Arabidopsis AEL gehiegi adierazten duten lerroak eta ael hirukoitz mutante bat erabiliz egindako fosfoproteomika ikerketa batek ez zuen DELLA proteinarik identifikatu kinasa hauen substratu gisa56. Eskuizkribua prestatu genuenean, jakinarazi zen GSK3-k, gari-gan (Triticum aestivum) GSK3/SHAGGY-antzeko kinasa bat kodetzen duen geneak, DELLA (Rht-B1b) fosforila dezakeela57, nahiz eta GSK3-k Rht-B1b-ren fosforilazioa ez den baieztatu landareetan. In vitro erreakzio entzimatikoek, GSK3-ren presentzian, eta ondoren masa-espektrometriako analisiak, Rht-B1b-ren DELLA eta GRAS domeinuen artean kokatutako hiru fosforilazio gune agerian utzi zituzten (3. irudi osagarria). Serinatik alaninarako hiru fosforilazio guneetan ordezkapenek Rht-B1b jarduera gutxitu zuten gari transgenikoan, gure aurkikuntzekin bat etorriz, Pep2 RGAko alanina ordezkapenek RGAren jarduera gutxitu baitzuten. Hala ere, in vitro proteinen degradazio-analisiak gehiago frogatu zuen fosforilazioak Rht-B1b57 ere egonkortu dezakeela. Hori kontrajarria da gure emaitzekin, Pep2 RGAko alanina ordezkapenek ez dutela bere egonkortasuna aldatzen plantan. Gari-GSK3 Arabidopsis-eko brassinoesteroideekiko sentikorra ez den proteina 2 (BIN2) ortologoa da 57. BIN2 BR seinaleztapenaren erregulatzaile negatiboa da, eta BR-k bere seinaleztapen-bidea aktibatzen du BIN2 degradazioa eraginez 58. Erakutsi genuen BR tratamenduak ez duela RGAren egonkortasuna 59 edo fosforilazio-mailak murrizten Arabidopsis-en (2. irudi osagarria), eta horrek iradokitzen du RGA ez dela litekeena BIN2-k fosforilatzea.
Datu kuantitatibo guztiak Excel erabiliz aztertu ziren estatistikoki, eta desberdintasun esanguratsuak Student-en t-testa erabiliz zehaztu ziren. Ez zen metodo estatistikorik erabili laginaren tamaina aldez aurretik zehazteko. Ez zen daturik baztertu analisitik; esperimentua ez zen ausazkoa izan; eta ikertzaileek banaketaren berri izan zuten esperimentuan eta emaitzen ebaluazioan zehar. Laginaren tamaina irudien legendeetan eta datu gordinen fitxategietan ematen da.
Argitaratze data: 2025eko apirilaren 15a