Kimuaren apikal meristemoaren (SAM) hazkuntza funtsezkoa da zurtoinaren arkitekturarako. Landare-hormonakgiberelinak(GA)ek funtsezko zeregina dute landareen hazkuntza koordinatzeko, baina haien zeregina SAM-ean oraindik ez da ondo ulertzen. Hemen, GA seinaleztapenaren biosentsore ratiometriko bat garatu dugu DELLA proteina diseinatuz, GA transkripzio-erantzunean duen funtsezko funtzio erregulatzailea kentzeko, GA aitortzean duen degradazioa mantenduz. Frogatzen dugu degradazioan oinarritutako biosentsore honek GA mailetan eta zelulen detekzioan izandako aldaketak zehaztasunez erregistratzen dituela garapenean zehar. Biosentsore hau erabili dugu SAM-ean GA seinaleztapenaren jarduera mapatzeko. Frogatzen dugu GA seinale altuak batez ere organo primordioen artean kokatutako zeluletan daudela, eta hauek internodo-zelulen aitzindariak direla. Funtzio-irabazi eta -galera ikuspegiak erabiliz, frogatzen dugu GA-k zelula-zatiketa-planoaren orientazioa erregulatzen duela, internodoen zelula-antolaketa kanonikoa ezarriz, eta horrela, SAM-ean internodoen zehaztapena sustatuz.
Kimuaren apexean kokatuta dagoen kimuaren meristemo apikalak (SAM) zelula amen nitxo bat dauka, eta haien jarduerak alboko organoak eta zurtoin-nodoak sortzen ditu landarearen bizitza osoan zehar modu modular eta iteratiboan. Unitate errepikakor horietako bakoitzak, edo landare-nodoek, internodoak eta alboko organoak ditu nodoetan, eta besapeko meristemoak hostoen axiletan1. Landare-nodoen hazkuntza eta antolaketa aldatzen dira garapenean zehar. Arabidopsis-en, internodoen hazkuntza inhibitzen da fase begetatiboan, eta besapeko meristemoak erroseta hostoen axiletan lozorroan geratzen dira. Lore-fasera igarotzean, SAM infloreszentzia-meristemo bihurtzen da, internodo luzangak eta besapeko kimuak, adartxoak hosto kaulinen axiletan eta, geroago, hostorik gabeko loreak2 sortuz. Hostoen, loreen eta adarren hasiera kontrolatzen duten mekanismoak ulertzeko aurrerapen handiak egin ditugun arren, nahiko gutxi dakigu internodoak nola sortzen diren.
GAen banaketa espazio-tenporala ulertzeak hormona hauen funtzioak ehun desberdinetan eta garapen-etapa desberdinetan hobeto ulertzen lagunduko du. Bere sustatzailearen ekintzapean adierazitako RGA-GFP fusioaren degradazioaren bistaratzea informazio garrantzitsua ematen du sustraietako GA maila osoen erregulazioari buruz15,16. Hala ere, RGAren adierazpena ehunen artean aldatzen da17 eta GA18-k erregulatzen du. Beraz, RGA sustatzailearen adierazpen desberdinak RGA-GFP-rekin behatutako fluoreszentzia-eredua eragin dezake eta, beraz, metodo hau ez da kuantitatiboa. Duela gutxi, fluoreszeina bioaktiboarekin (Fl) markatutako GA19,20-k GAren metaketa agerian utzi zuen sustraien endokortexean eta bere zelula-mailen erregulazioa GA garraioaren bidez. Duela gutxi, nlsGPS1 GA FRET sentsoreak erakutsi zuen GA mailak zelulen luzapenarekin korrelazionatzen direla sustraietan, filamentuetan eta hipokotilo ilunetan21. Hala ere, ikusi dugun bezala, GAren kontzentrazioa ez da GA seinaleztapen-jarduera kontrolatzen duen parametro bakarra, sentsore-prozesu konplexuen menpe baitago. Hemen, DELLA eta GA seinaleztapen bideen ulermenean oinarrituta, GA seinaleztapenerako degradazioan oinarritutako biosentsore arrazional baten garapena eta karakterizazioa aurkezten dugu. Biosentsore kuantitatibo hau garatzeko, proteina fluoreszente bati fusionatu eta ehunetan ubikuo adierazitako GArekiko sentikorra den RGA mutante bat erabili dugu, baita GArekiko sentikorra ez den proteina fluoreszente bat ere. Erakusten dugu RGA proteina mutanteen fusioek ez dutela GA seinaleztapen endogenoan oztopatzen ubikuo adierazitakoan, eta biosentsore honek GA sarreratik eta sentsore aparatuak GA seinaleztapen prozesamendutik sortutako seinaleztapen jarduera kuantifika dezakeela bereizmen espazio-tenporal handiarekin. Biosentsore hau erabili dugu GA seinaleztapen jardueraren banaketa espazio-tenporala mapatzeko eta GAk SAM epidermisean zelulen portaera nola erregulatzen duen kuantifikatzeko. Erakusten dugu GAk organo primordioen artean kokatutako SAM zelulen zatiketa planoaren orientazioa erregulatzen duela, horrela internodoaren zelula antolaketa kanonikoa definituz.
Azkenik, galdetu genuen ea qmRGA-k GA mailetan endogenoen aldaketak jakinarazi zitzakeen hazten ari diren hipokotiloak erabiliz. Aurretik erakutsi genuen nitratoak hazkundea estimulatzen duela GA sintesia handituz eta, aldi berean, DELLA34 degradazioa. Horrenbestez, ikusi genuen nitrato-hornidura ugariarekin (10 mM NO3−) hazitako pUBQ10::qmRGA landareen hipokotilo-luzera nabarmen luzeagoa zela nitrato-gabeziako baldintzetan hazitako landareena baino (6a irudi osagarria). Hazkunde-erantzunarekin bat etorriz, GA seinaleak altuagoak ziren 10 mM NO3− baldintzetan hazitako landareen hipokotiloetan nitratorik gabe hazitako landareetan baino (6b eta c irudi osagarriak). Horrela, qmRGA-k GA kontzentrazioaren aldaketa endogenoek eragindako GA seinaleztapenaren aldaketak monitorizatzea ere ahalbidetzen du.
qmRGA-k detektatutako GA seinaleztapen jarduera GA kontzentrazioaren eta GA pertzepzioaren araberakoa den ulertzeko, sentsorearen diseinuan oinarrituta espero zen bezala, hiru GID1 errezeptoreen adierazpena aztertu genuen ehun begetatiboan eta ugalketa-ehunetan. Landare-landareetan, GID1-GUS erreporter lerroak erakutsi zuen GID1a eta c kotiledoietan oso adierazita zeudela (3a-c irudia). Horrez gain, hiru errezeptoreak hostoetan, alboko sustraien primordietan, sustraien puntetan (GID1b-ren sustrai-txapela izan ezik) eta sistema baskularrean adierazi ziren (3a-c irudia). Infloreszentziaren SAM-ean, GUS seinaleak GID1b eta 1c-rentzat bakarrik detektatu genituen (7a-c irudi osagarria). In situ hibridazioak adierazpen-eredu hauek berretsi zituen eta, gainera, frogatu zuen GID1c maila baxuetan uniformeki adierazten zela SAM-ean, GID1b-k, berriz, adierazpen handiagoa erakutsi zuen SAM-aren periferian (7d-l irudi osagarria). pGID1b::2xmTQ2-GID1b itzulpen-fusioak GID1b espresio-tarte mailakatu bat ere agerian utzi zuen, SAMaren erdialdean espresio baxutik edo batere ez dagoenetik organoen ertzetan espresio handira (7m irudi osagarria). Beraz, GID1 hartzaileak ez daude uniformeki banatuta ehunetan zehar eta ehunen barruan. Ondorengo esperimentuetan, ikusi genuen GID1-en gehiegizko espresioak (pUBQ10::GID1a-mCherry) qmRGA-ren sentikortasuna handitu zuela hipokotiloetan kanpoko GA aplikazioarekiko (3d eta e irudiak). Aitzitik, qd17mRGA-k hipokotiloan neurtutako fluoreszentzia ez zen sentikorra GA3 tratamenduarekiko (3f eta g irudiak). Bi analisietarako, landareak GA kontzentrazio altuekin tratatu ziren (100 μM GA3) sentsorearen portaera azkarra ebaluatzeko, non GID1 hartzaileari lotzeko gaitasuna handitu edo galdu zen. Emaitza hauek batera, berresten dute qmRGA biosentsoreak GA eta GA sentsore gisa funtzio konbinatua betetzen duela, eta iradokitzen dute GID1 hartzailearen adierazpen desberdinak sentsorearen emisibitatea nabarmen modula dezakeela.
Gaur arte, GA seinalen banaketa SAM-en ez dago argi. Hori dela eta, qmRGA adierazten duten landareak eta pCLV3::mCherry-NLS zelula amen erreporter-a35 erabili genituen GA seinaleztapen jardueraren mapa kuantitatiboak bereizmen handikoak kalkulatzeko, L1 geruzan (epidermisa; 4a, b irudiak, ikus Metodoak eta Metodo Osagarriak), L1-ek funtsezko zeregina baitu SAM hazkuntza kontrolatzeko36. Hemen, pCLV3::mCherry-NLS adierazpenak erreferentzia puntu geometriko finko bat eman zuen GA seinaleztapen jardueraren banaketa espazio-tenporala aztertzeko37. GA funtsezkoa dela uste den arren organo lateralen garapenerako4, ikusi genuen GA seinaleak baxuak zirela lore-primordioan (P) P3 fasetik aurrera (4a, b irudiak), eta P1 eta P2 primordio gazteek, berriz, eskualde zentralekoaren antzeko jarduera moderatua zutela (4a, b irudiak). GA seinaleztapen-jarduera handiagoa detektatu zen organoen primordioen mugetan, P1/P2-tik hasita (mugaren alboetan) eta P4-n gailurra joz, baita primordioen artean kokatutako eskualde periferikoko zelula guztietan ere (4a, b irudiak eta 8a, b irudi osagarriak). GA seinaleztapen-jarduera handiago hau ez zen epidermisean bakarrik ikusi, baita L2 eta goiko L3 geruzetan ere (8b irudi osagarria). qmRGA erabiliz SAM-ean detektatutako GA seinalen eredua ere aldatu gabe mantendu zen denboran zehar (8c-f, k irudi osagarriak). Nahiz eta qd17mRGA eraikuntza sistematikoki beherantz erregulatu zen T3 landareen SAM-ean, guk zehatz-mehatz karakterizatu genituen bost lerro independenteetatik, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP eraikuntzarekin lortutako fluoreszentzia-ereduak aztertu ahal izan genituen (8g-j, l irudi osagarriak). Kontrol-lerro honetan, fluoreszentzia-erlazioan aldaketa txikiak baino ez ziren detektatu SAM-en, baina SAM zentroan TagBFP-rekin lotutako VENUS-en beherakada argi eta ustekabekoa ikusi genuen. Horrek berresten du qmRGA-k behatutako seinaleztapen-ereduak mRGA-VENUS-en GA-menpeko degradazioa islatzen duela, baina baita ere erakusten du qmRGA-k meristemoaren zentroko GA seinaleztapen-jarduera gehiegi estimatu dezakeela. Laburbilduz, gure emaitzek primordioen banaketa islatzen duen GA seinaleztapen-eredu bat erakusten dute. Primordio arteko eskualdearen (IPR) banaketa hau garatzen ari den primordioaren eta erdiko eskualdearen artean GA seinaleztapen-jarduera handia pixkanaka ezartzearen ondorioz gertatzen da, eta, aldi berean, primordioko GA seinaleztapen-jarduera gutxitzen den bitartean (4c eta d irudiak).
GID1b eta GID1c hartzaileen banaketak (ikus goian) iradokitzen du GA hartzaileen adierazpen desberdinek GA seinaleztapen jardueraren eredua moldatzen laguntzen dutela SAM-en. GAren metaketa desberdina inplikatuta egon ote daitekeen galdetu genuen geure buruari. Aukera hau ikertzeko, nlsGPS1 GA FRET sentsorea erabili genuen21. Aktibazio-maiztasun handiagoa detektatu zen 10 μM GA4+7-rekin 100 minutuz tratatutako nlsGPS1-en SAMan (9a-e irudi osagarria), eta horrek adierazten du nlsGPS1-ek SAM-en GA kontzentrazioaren aldaketei erantzuten diela, sustraietan bezala21. nlsGPS1-en aktibazio-maiztasunaren banaketa espazialak GA maila nahiko baxuak agerian utzi zituen SAM-en kanpoko geruzetan, baina SAM-en erdian eta ertzetan altuagoak zirela erakutsi zuen (4e irudia eta 9a eta c irudi osagarriak). Horrek iradokitzen du GA ere banatzen dela SAM-en qmRGA-k agerian utzitakoaren pareko eredu espazial batekin. Ikuspegi osagarri gisa, SAM GA fluoreszentearekin (GA3-, GA4-, GA7-Fl) edo Fl bakarrik kontrol negatibo gisa tratatu genuen. Fl seinalea SAM osoan banatu zen, erdiko eskualdea eta primordioa barne, intentsitate txikiagoan izan arren (4j irudia eta 10d irudi osagarria). Aldiz, hiru GA-Fl guztiak primordioaren mugetan pilatu ziren zehazki eta IPRaren gainerakoan maila desberdinetan, GA7-Fl IPRko domeinu handienean pilatuz (4k irudia eta 10a eta b irudi osagarriak). Fluoreszentzia intentsitatearen kuantifikazioak agerian utzi zuen IPR eta IPR gabeko intentsitatearen erlazioa handiagoa zela GA-Fl-rekin tratatutako SAM-ean Fl-rekin tratatutako SAM-arekin alderatuta (4l irudia eta 10c irudi osagarria). Emaitza hauek guztiek iradokitzen dute GA kontzentrazio handiagoetan dagoela organoen mugatik hurbilen dauden IPR zeluletan. Honek iradokitzen du SAM GA seinaleztapen-jardueraren patroia GA hartzaileen adierazpen desberdinaren eta organoen ertzetan dauden IPR zeluletan GA metatze desberdinaren ondorio dela. Beraz, gure analisiak GA seinaleztapenaren patroi espazio-tenporal ustekabeko bat agerian utzi zuen, jarduera txikiagoa SAM-en erdigunean eta primordioan eta jarduera handiagoa eskualde periferikoko IPR-an.
SAM-en GA seinaleztapen-jarduera diferentzialaren eginkizuna ulertzeko, GA seinaleztapen-jardueraren, zelulen hedapenaren eta zelulen zatiketaren arteko korrelazioa aztertu genuen SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ren denbora errealeko irudiak erabiliz. Hazkuntza-erregulazioan GA-k duen eginkizuna kontuan hartuta, zelulen hedapen-parametroekin korrelazio positiboa espero zen. Hori dela eta, lehenik GA seinaleztapen-jardueraren mapak zelula-gainazaleko hazkunde-tasaren mapekin alderatu genituen (zelula jakin baterako eta zatiketan dauden alaba-zeluletarako zelulen hedapenaren indarraren ordezkari gisa) eta hazkunde-anisotropiaren mapekin, zelulen hedapenaren norabidetasuna neurtzen duena (hemen ere erabiltzen da zelula jakin baterako eta zatiketan dauden alaba-zeluletarako; 5a,b irudiak, ikus Metodoak eta Metodo Osagarriak). SAM zelulen gainazaleko hazkunde-tasaren gure mapak aurreko behaketekin bat datoz38,39, hazkunde-tasa minimoak mugan eta hazkunde-tasa maximoak garatzen ari diren loreetan (5a irudia). Osagai nagusien analisiak (PCA) erakutsi zuen GA seinaleztapen-jarduera negatiboki korrelazionatuta zegoela zelula-gainazaleko hazkunde-intentsitatearekin (5c irudia). Era berean, erakutsi genuen aldakuntza-ardatz nagusiak, GA seinaleztapenaren sarrera eta hazkunde-intentsitatea barne, CLV3 espresio altuak zehaztutako norabidearekiko ortogonalak zirela, gainerako analisietan SAM zentrotik zelulak baztertzea baieztatuz. Spearman korrelazio-analisiak PCA emaitzak berretsi zituen (5d irudia), eta adierazi zuen IPR-ko GA seinale altuagoek ez zutela zelulen hedapen handiagoa eragin. Hala ere, korrelazio-analisiak korrelazio positibo txiki bat agerian utzi zuen GA seinaleztapen-jardueraren eta hazkunde-anisotropiaren artean (5c eta d irudiak), eta horrek iradokitzen du IPR-ko GA seinaleztapen altuagoak zelulen hazkundearen norabidean eta, agian, zelulen zatiketa-planoaren posizioan eragina duela.
a, b SAM-en batez besteko gainazaleko hazkundearen (a) eta hazkunde-anisotropiaren (b) bero-mapak zazpi landare independenteren batez bestekoak izanik (zelulen hedapenaren indarraren eta norabidearen ordezko gisa erabiliak, hurrenez hurren). c PCA analisiak aldagai hauek barne hartu zituen: GA seinalea, gainazaleko hazkunde-intentsitatea, gainazaleko hazkunde-anisotropia eta CLV3 adierazpena. PCA 1. osagaia batez ere negatiboki korrelazionatuta zegoen gainazaleko hazkunde-intentsitatearekin eta positiboki korrelazionatuta zegoen GA seinalearekin. PCA 2. osagaia batez ere positiboki korrelazionatuta zegoen gainazaleko hazkunde-anisotropiarekin eta negatiboki korrelazionatuta zegoen CLV3 adierazpenarekin. Ehunekoak osagai bakoitzak azaltzen duen aldakuntza adierazten dute. d Spearman korrelazio-analisia GA seinalearen, gainazaleko hazkunde-intentsitatearen eta gainazaleko hazkunde-anisotropiaren artean, ehunen eskalan, CZ kenduta. Eskuineko zenbakia bi aldagaien arteko Spearman rho balioa da. Izartxoek korrelazioa/korrelazio negatiboa oso esanguratsua den kasuak adierazten dituzte. e Col-0 SAM L1 zelulen 3D bistaratzea mikroskopia konfokal bidez. SAM-en (baina ez primordioan) 10 ordutan eratutako zelula-horma berriak beren angelu-balioen arabera koloreztatzen dira. Kolore-barra beheko eskuineko izkinan ageri da. Txertatutako irudiak dagokion 3D irudia erakusten du 0 ordutan. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen emaitza berdinekin. f Kaxa-diagramek zelulen zatiketa-tasak erakusten dituzte IPR eta IPR gabeko Col-0 SAM-en (n = 10 landare independente). Erdiko lerroak mediana erakusten du, eta kaxa-mugek 25. eta 75. pertzentilak adierazten dituzte. Biboteek R softwarearekin zehaztutako gutxieneko eta gehieneko balioak adierazten dituzte. P balioak Welch-en bi isatseko t-testarekin lortu ziren. g, h Eskema-diagrama: (g) zelula-horma berriaren angelua (magenta) nola neurtu SAM-aren erdigunetik norabide erradialarekiko (marra puntu zuria) (angelu zorrotzen balioak bakarrik hartzen dira kontuan, hau da, 0-90°), eta (h) meristemoaren barruko zirkunferentzial/lateral eta erradial norabideak. i Zelula-zatiketa-planoaren orientazioaren maiztasun-histogramak SAM-ean (urdin iluna), IPR-an (urdin ertaina) eta IPR gabekoan (urdin argia), hurrenez hurren. P balioak bi isatseko Kolmogorov-Smirnov testaren bidez lortu ziren. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen emaitza antzekoekin. j IPR-ren zelula-zatiketa-planoaren orientazioaren maiztasun-histogramak P3 (berde argia), P4 (berde ertaina) eta P5 (berde iluna) inguruan, hurrenez hurren. P balioak bi isatseko Kolmogorov-Smirnov testaren bidez lortu ziren. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen emaitza antzekoekin.
Beraz, ondoren, GA seinaleztapenaren eta zelulen zatiketa-jardueraren arteko korrelazioa ikertu genuen, analisian zehar zelula-horma berriak identifikatuz (5e irudia). Ikuspegi honek zelulen zatiketaren maiztasuna eta norabidea neurtzeko aukera eman zigun. Harrigarria bada ere, ikusi genuen IPR-an eta gainerako SAM-ean (IPR ez dena, 5f irudia) zelula-zatiketen maiztasuna antzekoa zela, eta horrek adierazten du IPR eta IPR ez diren zelulen arteko GA seinaleztapenaren desberdintasunek ez dutela zelula-zatiketa nabarmen eragiten. Honek, eta GA seinaleztapenaren eta hazkuntza-anisotropiaren arteko korrelazio positiboak, bultzatu gintuen GA seinaleztapenaren jarduerak zelulen zatiketa-planoaren orientazioan eragina izan zezakeen aztertzera. Zelula-horma berriaren orientazioa neurtu genuen meristemoaren erdigunea eta zelula-horma berriaren erdigunea lotzen dituen ardatz erradialarekiko angelu zorrotz gisa (5e-i irudia) eta zelulek ardatz erradialarekiko 90°-tik gertuko angeluetan zatitzeko joera argia ikusi genuen, maiztasun handienak 70-80° (% 23,28) eta 80-90° (% 22,62) artean ikusi zirelarik (5e,i irudia), zirkunferentzial/zeharkako norabideko zelula-zatiketei dagozkienak (5h irudia). GA seinaleztapenak zelula-zatiketa-portaera honetan duen ekarpena aztertzeko, IPR-ko eta IPR ez den zelula-zatiketa-parametroak bereizita aztertu genituen (5i irudia). IPR zelulen zatiketa-angeluen banaketa IPR ez diren zelulen edo SAM osoko zelulen banaketatik desberdina zela ikusi genuen, IPR zelulek zelula-zatiketa lateral/zirkular proportzio handiagoa erakusten zutelarik, hau da, 70–80° eta 80–90° (% 33,86 eta % 30,71, hurrenez hurren, proportzio berdinak) (5i irudia). Beraz, gure behaketek GA seinaleztapen altuaren eta zelula-zatiketa-planoaren orientazio zirkunferentzialaren norabidetik gertu dagoenaren arteko lotura agerian utzi zuten, GA seinaleztapen-jardueraren eta hazkuntza-anisotropiaren arteko korrelazioaren antzekoa (5c eta d irudiak). Elkarte honen kontserbazio espaziala gehiago ezartzeko, zatiketa-planoaren orientazioa neurtu genuen primordioa inguratzen duten IPR zeluletan, P3tik hasita, GA seinaleztapen-jarduera handiena eskualde honetan detektatu baitzen P4tik hasita (4. irudia). IPRren zatiketa-angeluek P3 eta P4 inguruan ez zuten desberdintasun estatistikoki esanguratsurik erakutsi, nahiz eta zelula-zatiketa lateralen maiztasun handiagoa ikusi zen P4 inguruko IPRn (5j irudia). Hala ere, P5 inguruko IPR zeluletan, zelula-zatiketa planoaren orientazioaren aldea estatistikoki esanguratsua bihurtu zen, zeharkako zelula-zatiketen maiztasuna nabarmen handituz (5j irudia). Emaitza hauek guztiek iradokitzen dute GA seinaleztapenak SAM-eko zelula-zatiketen orientazioa kontrola dezakeela, eta hori bat dator aurreko txostenekin40,41, GA seinaleztapen altuak IPR-eko zelula-zatiketen alboko orientazioa eragin dezakeela diotenekin.
IPR-ko zelulak ez direla primordioetan sartuko aurreikusten da, baizik eta internodoetan2,42,43. IPR-ko zelula-zatiketen zeharkako orientazioak epidermis-zelulen luzetarako ilara paraleloen ohiko antolaketa ekar dezake internodoetan. Goian deskribatutako gure behaketek iradokitzen dute GA seinaleztapenak zeregin bat duela prozesu honetan, zelulen zatiketaren norabidea erregulatuz.
Hainbat DELLA geneen funtzio galerak GA erantzun konstitutibo bat eragiten du, eta della mutanteak erabil daitezke hipotesi hau probatzeko44. Lehenik eta behin, bost DELLA geneen adierazpen-ereduak aztertu genituen SAM-en. GUS lerroaren transkripzio-fusioak45 agerian utzi zuen GAI, RGA, RGL1 eta RGL2 (neurri askoz txikiagoan) SAM-en adierazten zirela (11a-d irudi osagarria). In situ hibridazioak, gainera, frogatu zuen GAI mRNA primordioetan eta garatzen ari diren loreetan pilatzen dela bereziki (11e irudi osagarria). RGL1 eta RGL3 mRNA detektatu ziren SAM-eko hostopil osoan eta lore zaharragoetan, RGL2 mRNA ugariagoa zen bitartean mugako eskualdean (11f-h irudi osagarria). pRGL3::RGL3-GFP SAM-en irudi konfokalak in situ hibridazioaren bidez behatutako adierazpena berretsi zuen eta RGL3 proteina SAM-en erdiko zatian pilatzen dela erakutsi zuen (11i irudi osagarria). pRGA::GFP-RGA lerroa erabiliz, RGA proteina SAM-en metatzen dela ere ikusi genuen, baina bere ugaritasuna gutxitzen dela mugan P4-tik aurrera (11j irudi osagarria). Aipagarria da, RGL3 eta RGA-ren adierazpen-ereduak IPR-n GA seinaleztapen-jarduera handiagoarekin bat datozela, qmRGA-k detektatu bezala (4. irudia). Gainera, datu hauek adierazten dute DELLA guztiak SAM-en adierazten direla eta haien adierazpenak, oro har, SAM osoa hartzen duela.
Ondoren, zelula-zatiketaren parametroak aztertu genituen SAM mota basatian (Ler, kontrol) eta gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della bostuple (global) mutanteetan (6a, b irudiak). Interesgarria da, zelula-zatiketaren angeluen maiztasunen banaketan aldaketa estatistikoki esanguratsua ikusi genuela della global mutante SAMean mota basatiarekin alderatuta (6c irudia). Della global mutantearen aldaketa hau 80-90° angeluen maiztasunaren igoeraren ondorioz gertatu zen (% 34,71 vs. % 24,55) eta, neurri txikiagoan bada ere, 70-80° angeluen maiztasunaren igoeraren ondorioz (% 23,78 vs. % 20,18), hau da, zeharkako zelula-zatiketei dagozkienak (6c irudia). Zeharkako ez diren zatiketen maiztasuna (0-60°) ere txikiagoa izan zen della global mutantean (6c irudia). Zeharkako zelula-zatiketen maiztasuna nabarmen handitu zen della global mutantearen SAMean (6b irudia). IPR-n zeharkako zelula-zatiketen maiztasuna ere handiagoa izan zen della global mutantean, mota basatiarekin alderatuta (6d irudia). IPR eskualdetik kanpo, mota basatiak zelula-zatiketa angeluen banaketa uniformeagoa zuen, della global mutanteak, berriz, IPR bezalako zatiketa tangentzialak nahiago zituen (6e irudia). Gainera, ga2 oxidasa (ga2ox) boskoitzeko mutanteen (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 eta ga2ox6-2) SAM-ean zelula-zatiketen orientazioa kuantifikatu genuen, GA inaktibo den mutante-hondo bat, non GA metatzen den. GA mailen igoerarekin bat etorriz, ga2ox mutante boskoitzaren infloreszentziaren SAM Col-0rena baino handiagoa zen (12a eta b irudi osagarria), eta Col-0rekin alderatuta, ga2ox SAM boskoitzak zelula-zatiketa angeluen banaketa nabarmen desberdina erakutsi zuen, angelu-maiztasuna 50°-tik 90°-ra igoz, hau da, berriro ere zatiketa tangentzialak faboratzen (12a-c irudi osagarria). Horrela, erakusten dugu GA seinaleztapenaren aktibazio konstitutiboak eta GA metaketak zelula-zatiketa lateralak eragiten dituztela IPR-an eta gainerako SAM-ean.
a, b PIz tindatutako Ler (a) eta della mutante globalaren (b) SAM-en L1 geruzaren 3D bistaratzea mikroskopia konfokala erabiliz. SAM-ean (baina ez primordioan) 10 orduko epean sortutako zelula-horma berriak erakusten dira eta haien angelu-balioen arabera koloreztatzen dira. Txertatutako irudiak SAM 0 ordutan erakusten du. Kolore-barra beheko eskuineko izkinan bistaratzen da. (b) geziak della mutante globaleko zelula-fitxategi lerrokatuen adibide bat adierazten du. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen emaitza berdinekin. Zelula-zatiketa-planoaren orientazioen maiztasun-banaketaren konparaketa SAM osoan (d), IPR-n (e) eta IPR ez den (f) Ler eta della globalaren artean. P balioak Kolmogorov-Smirnov proba bikoitza erabiliz lortu ziren. f, g Col-0 (i) eta pCUC2::gai-1-VENUS (j) landare transgenikoen PIz tindatutako SAM-en irudi konfokalen 3D bistaratzea. (a, b) panelek SAM-ean 10 orduko epean sortutako zelula-horma berriak (baina ez primordia) erakusten dituzte. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen emaitza berdinekin. h–j SAM osoan (h), IPR-an (i) eta ez-IPR-an (j) Col-0 eta pCUC2::gai-1-VENUS landareen artean kokatutako zelula-zatiketa-planoaren orientazioen maiztasun-banaketaren konparaketa. P balioak Kolmogorov-Smirnov testa erabiliz lortu ziren.
Ondoren, GA seinaleztapena inhibitzearen eragina probatu genuen zehazki IPR-n. Horretarako, kotiledoi kopa 2 (CUC2) sustatzailea erabili genuen VENUS-ekin fusionatutako gai-1 proteina negatibo dominante baten adierazpena bultzatzeko (pCUC2::gai-1-VENUS lerroan). SAM mota basatian, CUC2 sustatzaileak IPR gehienen adierazpena bultzatzen du SAM-en, mugako zelulak barne, P4-tik aurrera, eta antzeko adierazpen espezifikoa ikusi zen pCUC2::gai-1-VENUS landareetan (ikus behean). Zelula-zatiketa angeluen banaketa SAM-en edo pCUC2::gai-1-VENUS landareen IPR-a ez zen nabarmen desberdina mota basatiarenarekin alderatuta, nahiz eta ustekabean ikusi genuen landare hauetan IPRrik gabeko zelulak 80-90°-ko maiztasun handiagoan zatitzen zirela (6f-j irudia).
Zelulen zatiketaren norabidea SAMen geometriaren araberakoa dela iradoki da, bereziki ehunen kurbadurak sortutako tentsio-tentsioaren araberakoa46. Beraz, galdetu genuen ea SAMen forma aldatuta zegoen della global mutantean eta pCUC2::gai-1-VENUS landareetan. Aurretik jakinarazi bezala12, della global mutantearen SAM tamaina mota basatiarena baino handiagoa zen (13a, b, d irudi osagarria). CLV3 eta STM RNAren in situ hibridazioak meristemoaren hedapena baieztatu zuen della mutanteetan eta zelula amen nitxoaren alboko hedapena erakutsi zuen (13e irudi osagarria, f, h, i). Hala ere, SAMen kurbadura antzekoa zen bi genotipoetan (13k irudi osagarria, m, n, p). Tamaina-igoera antzekoa ikusi genuen gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della laukoitzeko mutantean, kurbadura-aldaketarik gabe mota basatiarekin alderatuta (13c irudi osagarria, d, g, j, l, o, p). Zelulen zatiketaren orientazioaren maiztasuna ere eragin zuen della laukoitzeko mutantean, baina della monolitiko mutantean baino neurri txikiagoan (12d-f irudi osagarria). Dosi efektu honek, kurbaduran eraginik ez izatearekin batera, iradokitzen du Della laukoitzeko mutantean geratzen den RGL3 jarduerak DELLA jardueraren galerak eragindako zelula zatiketaren orientazioaren aldaketak mugatzen dituela eta zelula zatiketa lateraletan izandako aldaketak GA seinaleztapen jardueraren aldaketen ondorioz gertatzen direla, SAM geometriaren aldaketen ordez. Goian deskribatu bezala, CUC2 sustatzaileak IPR adierazpena bultzatzen du SAM-en P4-tik hasita (14a, b irudi osagarria), eta, aldiz, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ek tamaina txikiagoa baina kurbadura handiagoa zuen (14c-h irudi osagarria). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiaren aldaketa honek tentsio mekanikoen banaketa desberdina eragin dezake mota basatiarekin alderatuta, non zirkunferentzia tentsio altuak SAM zentrotik distantzia laburragoan hasten diren47. Bestela, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiaren aldaketak transgeneen adierazpenak eragindako eskualdeko propietate mekanikoen aldaketen ondorioz gerta daitezke48. Bi kasuetan, honek GA seinaleztapenaren aldaketen efektuak partzialki konpentsatu ditzake, zelulek zirkunferentzialki/zeharkako orientazioan zatitzeko probabilitatea handituz, gure behaketak azalduz.
Gure datuek, oro har, baieztatzen dute GA seinaleztapen handiagoak zeregin aktiboa duela zelula-zatiketa-planoaren alboko orientazioan IPR-n. Era berean, erakusten dute meristemoaren kurbadurak ere zelula-zatiketa-planoaren orientazioan eragina duela IPR-n.
IPR-an zatiketa-planoaren zeharkako orientazioak, GA seinaleztapen-jarduera handia dela eta, iradokitzen du GA-k zelula-fitxategi erradial bat aurrez antolatzen duela epidermisan SAM-en barruan, geroago epidermis-internodoan aurkituko den zelula-antolaketa definitzeko. Izan ere, zelula-fitxategi horiek maiz ikusten ziren della globalen mutanteen SAM irudietan (6b irudia). Beraz, SAM-eko GA seinaleztapenaren espazial-ereduaren garapen-funtzioa gehiago aztertzeko, denbora-tarteko irudigintza erabili genuen IPR-ko zelulen espazial-antolaketa aztertzeko landare mota basatietan (Ler eta Col-0), della globalen mutanteetan eta pCUC2::gai-1-VENUS landare transgenikoetan.
qmRGA-k IPR-ko GA seinaleztapen jarduera P1/P2-tik handitzen zela eta P4-n gailurra jotzen zuela erakutsi zuela ikusi genuen, eta eredu hau denboran zehar konstante mantentzen zela (4a-f irudiak eta 8c-f, k irudi osagarriak). GA seinalea handitzen den heinean IPR-ko zelulen antolaketa espaziala aztertzeko, P4-ren gainean eta alboetan dauden Ler IPR zelulak etiketatu genituen, lehen behaketaren ondorengo 34 orduetan aztertutako garapen-patuaren arabera, hau da, bi plastido baino gehiagotan, eta horrek IPR zelulak primordioaren garapenean zehar jarraitzeko aukera eman zigun P1/P2-tik P4-ra. Hiru kolore desberdin erabili genituen: horia P4-ren ondoan primordioan integratu ziren zelulentzat, berdea IPR-n zeudenentzat eta morea bi prozesuetan parte hartu zutenentzat (7a-c irudiak). t0-n (0 h), IPR zelulen 1-2 geruza ikusten ziren P4-ren aurrean (7a irudia). Espero bezala, zelula hauek zatitu zirenean, batez ere zeharkako zatiketa-planoaren bidez egin zuten (7a-c irudiak). Emaitza antzekoak lortu ziren Col-0 SAM erabiliz (P3-n zentratuz, zeinaren ertza Ler-eko P4-ren antzera tolesten den), nahiz eta genotipo honetan lore-ertzean sortutako tolesturak IPR zelulak azkarrago ezkutatu zituen (7g-i irudia). Horrela, IPR zelulen zatiketa-ereduak zelulak erradial ilaratan aurre-antolatzen ditu, internodoetan bezala. Erradial ilara horien antolaketak eta IPR zelulen lokalizazioak organoen artean iradokitzen dute zelula hauek internodoen aitzindariak direla.
Hemen, qmRGA izeneko GA seinaleztapen biosentsore ratiometriko bat garatu dugu, GA eta GA hartzaileen kontzentrazio konbinatuen ondoriozko GA seinaleztapen jardueraren mapaketa kuantitatiboa ahalbidetzen duena, seinaleztapen bide endogenoekin interferentzia minimizatuz, horrela GA funtzioari buruzko informazioa emanez zelula mailan. Horretarako, mRGA izeneko DELLA proteina aldatu bat eraiki dugu, DELLA interakzio bazkideei lotzeko gaitasuna galdu duena, baina GAk eragindako proteolisiarekiko sentikorra izaten jarraitzen duena. qmRGA-k GA mailetan gertatzen diren aldaketa exogeno eta endogenoei erantzuten die, eta bere sentsore dinamikoen propietateek garapenean zehar GA seinaleztapen jardueran gertatzen diren aldaketa espazio-tenporalak ebaluatzea ahalbidetzen dute. qmRGA tresna oso malgua da, ehun desberdinetara egokitu baitaiteke bere adierazpenerako erabiltzen den sustatzailea aldatuz (beharrezkoa bada), eta angiospermoetan zehar GA seinaleztapen bidearen eta PFYRE motiboaren izaera kontserbatua kontuan hartuta, litekeena da beste espezie batzuetara transferitzea22. Honekin bat etorriz, arrozaren SLR1 DELLA proteinan (HYY497AAA) mutazio baliokide batek ere SLR1-en hazkuntza-errepresorearen jarduera murrizten duela frogatu da, GA-k eragindako degradazioa apur bat murriztuz, mRGA23-ren antzera. Aipagarria da, Arabidopsis-en egindako azken ikerketek erakutsi dutela PFYRE domeinuko aminoazido-mutazio bakar batek (S474L) RGA-ren transkripzio-jarduera aldatzen zuela, transkripzio-faktore bazkideekin elkarreragiteko duen gaitasunean eragin gabe50. Mutazio hau mRGA-n dauden 3 aminoazido-ordezkapenetatik oso gertu dagoen arren, gure ikerketek erakusten dute bi mutazio hauek DELLA-ren ezaugarri desberdinak aldatzen dituztela. Transkripzio-faktore bazkide gehienak DELLA26,51-ren LHR1 eta SAW domeinuetara lotzen diren arren, PFYRE domeinuko aminoazido kontserbatu batzuek elkarreragin horiek egonkortzen lagun dezakete.
Internodoen garapena landareen arkitekturan eta errendimenduaren hobekuntzan ezaugarri gakoa da. qmRGA-k GA seinaleztapen-jarduera handiagoa erakutsi zuen IPR internodoen aitzindari-zeluletan. Irudi kuantitatiboak eta genetika konbinatuz, erakutsi genuen GA seinaleztapen-ereduek zelula-zatiketa-plano zirkularrak/zeharkakoak gainjartzen dituztela SAM epidermisean, internodoen garapenerako beharrezkoa den zelula-zatiketa-antolaketa moldatuz. Zelulen zatiketa-planoaren orientazioaren hainbat erregulatzaile identifikatu dira garapenean zehar52,53. Gure lanak GA seinaleztapen-jarduerak zelula-parametro hau nola erregulatzen duen erakusten duen adibide argia eskaintzen du. DELLA-k aurre-tolesturako proteina-konplexuekin elkarreragin dezake41, beraz, GA seinaleztapenak zelula-zatiketa-planoaren orientazioa erregula dezake kortexeko mikrotubulu-orientazioan zuzenean eraginez40,41,54,55. Ustekabean erakutsi genuen SAM-en, GA seinaleztapen-jarduera handiagoaren korrelazioa ez zela zelulen luzapena edo zatiketa, baizik eta hazkuntza-anisotropia soilik, eta hori bat dator GA-k IPR-n zelula-zatiketaren norabidean duen eragin zuzenarekin. Hala ere, ezin dugu baztertu efektu hau zeharkakoa ere izan daitekeenik, adibidez, GA-k eragindako zelula-hormaren biguntzeak eragindakoa56. Zelula-hormaren propietateen aldaketek estres mekanikoa eragiten dute57,58, eta horrek zelula-zatiketa-planoaren orientazioan ere eragina izan dezake kortexeko mikrotubuluen orientazioan eraginez39,46,59. GAk eragindako estres mekanikoaren eta GAk mikrotubuluen orientazioaren erregulazio zuzenaren efektu konbinatuak IPR-an zelula-zatiketa orientazioaren eredu espezifiko bat sortzen parte har dezakete internodoak definitzeko, eta ikerketa gehiago behar dira ideia hau probatzeko. Era berean, aurreko ikerketek DELLArekin elkarreragiten duten TCP14 eta 15 proteinen garrantzia azpimarratu dute internodoen eraketaren kontrolean60,61 eta faktore hauek GAren ekintza bitarteka dezakete BREVIPEDICELLUS (BP) eta PENNYWISE (PNY) proteinekin batera, internodoen garapena erregulatzen dutenak eta GAren seinaleztapena eragiten dutela frogatu baita2,62. DELLAek brassinosteroide, etileno, azido jasmoniko eta azido abszisiko (ABA) seinaleztapen bideekin elkarreragiten dutela kontuan hartuta63,64 eta hormona hauek mikrotubuluen orientazioan eragina izan dezaketela65, GAk zelulen zatiketaren orientazioan dituen efektuak beste hormona batzuek ere bitarteka ditzakete.
Lehenengo zitologia-ikerketek erakutsi zuten Arabidopsis SAMaren barneko eta kanpoko eskualdeak beharrezkoak direla internodoen garapenerako2,42. GAk barneko ehunetan zelula-zatiketa aktiboki erregulatzen duen egitateak12 GAren funtzio bikoitza onartzen du SAMean meristemoaren eta internodoen tamaina erregulatzeko. Zelulen zatiketa norabidetuaren eredua ere zorrotz araututa dago barneko SAM ehunean, eta erregulazio hau ezinbestekoa da zurtoinaren hazkuntzarako52. Interesgarria izango da aztertzea ea GAk ere zereginik duen zelula-zatiketa planoa orientatzeko barneko SAM antolakuntzan, horrela SAMaren barruko internodoen zehaztapena eta garapena sinkronizatuz.
Landareak in vitro lurzoruan edo 1x Murashige-Skoog (MS) medioan (Duchefa) hazi ziren, % 1eko sakarosa eta % 1eko agarrarekin (Sigma) osatuta, baldintza estandarretan (16 orduko argia, 22 °C), hipokotilo eta sustraien hazkuntza esperimentuetan izan ezik, non plantulak plaka bertikaletan hazi ziren argi konstantepean eta 22 °C-tan. Nitrato esperimentuetarako, landareak MS medio aldatuan (bioWORLD plant medium) hazi ziren, nitrato egokiarekin (0 edo 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukzinatoarekin, % 1eko sakarosa eta % 1eko A-agarrarekin (Sigma) osatuta, egun luzeko baldintzetan.
pDONR221-en txertatutako GID1a cDNA pDONR P4-P1R-pUBQ10 eta pDONR P2R-P3-mCherry-rekin birkonbinatu zen pB7m34GW-n pUBQ10::GID1a-mCherry sortzeko. pDONR221-en txertatutako IDD2 DNA pB7RWG266-n birkonbinatu zen p35S:IDD2-RFP sortzeko. pGID1b::2xmTQ2-GID1b sortzeko, GID1b kodetze eskualdearen goialdean dagoen 3,9 kb-ko zati bat eta GID1b cDNA (1,3 kb) eta terminatzailea (3,4 kb) dituen 4,7 kb-ko zati bat anplifikatu ziren lehenik 3. taula osagarriko primerrak erabiliz eta ondoren pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) eta pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) bektoreetan sartu ziren, hurrenez hurren, eta azkenik pDONR221 2xmTQ268-rekin birkonbinatu ziren pGreen 012567 helburu bektorean Gateway klonazioa erabiliz. pCUC2::LSSmOrange sortzeko, CUC2 sustatzaile-sekuentzia (ATG-tik gora 3229 bp), eta ondoren Stokes-shifted mOrange handiaren kodetze-sekuentzia (LSSmOrange)69 N7 lokalizazio nuklearraren seinalearekin eta NOS transkripzio-terminatzailearekin, pGreen kanamizina bideratzeko bektorean muntatu ziren Gateway 3 zatikiko birkonbinazio sistema (Invitrogen) erabiliz. Landare-bektore bitarra Agrobacterium tumefaciens GV3101 anduian sartu zen eta Nicotiana benthamiana hostoetan Agrobacterium infiltrazio-metodoaren bidez eta Arabidopsis thaliana Col-0-n lore-murgiltze-metodoaren bidez, hurrenez hurren. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry eta pCLV3::mCherry-NLS qmRGA gurutzaketen F3 eta F1 ondorengoetatik isolatu ziren, hurrenez hurren.
RNA in situ hibridazioa gutxi gorabehera 1 cm-ko luzerako kimu-puntetan egin zen72, bildu eta berehala FAA disoluzioan (% 3,7 formaldehidoa, % 5 azido azetikoa, % 50 etanola) finkatu zirenak, 4 °C-tan aurrez hoztuta. 2 × 15 minutuko huts-tratamenduen ondoren, finkatzailea aldatu zen eta laginak gau osoan inkubatu ziren. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 eta RGL3 cDNAk eta haien 3′-UTR-etarako antisentido zundak sintetizatu ziren 3. taula osagarrian erakusten diren primerrak erabiliz, Rosier et al.-ek deskribatutako moduan73. Digoxigeninaz markatutako zundak digoxigenina antigorputzak erabiliz immunodetektatu ziren (3000 aldizko diluzioa; Roche, katalogo zenbakia: 11 093 274 910), eta atalak 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfato (BCIP, 250 aldizko diluzioa)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200 aldizko diluzioa) disoluzioarekin tindatu ziren.
Argitaratze data: 2025eko otsailaren 10a