Shoot apical meristem (SAM) hazkundea funtsezkoa da zurtoinen arkitekturarako. Landare hormonakgiberelinak(GA) funtsezko eginkizunak betetzen dituzte landareen hazkuntza koordinatzean, baina SAMn duten zeregina ez da oso ondo ulertzen. Hemen, GA seinaleztapenaren biosentsore erraziometriko bat garatu dugu DELLA proteina ingeniarituz, GA transkripzio-erantzunean bere funtsezko erregulazio-funtzioa kentzeko, GA aitortzean bere degradazioa mantenduz. Degradazioan oinarritutako biosentsore honek garapenean zehar GA mailen eta sentsore zelularren aldaketak zehaztasunez erregistratzen dituela frogatzen dugu. Biosentsore hau erabili dugu SAM-en GA seinaleztapenaren jarduera mapatzeko. Erakusten dugu GA seinale altuak nagusiki organo primordioen artean kokatutako zeluletan daudela, zeinak barne-nodoen zelulen aitzindari diren. Funtzio-irabazi- eta galera-ikuspegiak erabiliz, GAk zelula-zatiketa-planoaren orientazioa erregulatzen duela frogatzen dugu, internodoen antolamendu zelular kanonikoa ezarriz, eta, horrela, SAM-en entrenodoen zehaztapena sustatzen du.
Kimuaren apical meristemak (SAM), kimuaren erpinean kokatuta, zelula amaren nitxo bat dauka, zeinen jarduerak alboko organoak eta zurtoin-nodoak sortzen ditu landarearen bizitzan zehar modu modular eta iteratiboan. Errepikatzen diren unitate edo landare-nodo horietako bakoitzak barne-nodoak eta albo-organoak barne hartzen ditu nodoetan, eta axil-meristemak hosto-axetan1. Landare-nodoen hazkundea eta antolaketa garapenean zehar aldatzen dira. Arabidopsis-en, barne-hazkundea fase begetatiboan ezabatzen da, eta meristemo axilarrak lozorroan geratzen dira erroseta hostoen axiletan. Lore faserako trantsizioan, SAM infloreszentzia meristemo bilakatzen da, barne-nodo luzangak eta axilar-begiak, hosto kaulinoen adarretan adarrak sortuz eta, geroago, hostorik gabeko loreak2. Hostoen, loreen eta adarren hasiera kontrolatzen duten mekanismoak ulertzeko aurrerapen esanguratsuak egin baditugu ere, nahiko gutxi dakigu entrenodoak nola sortzen diren.
GAen banaketa espazio-denborala ulertzeak hormona horien funtzioak hobeto ulertzen lagunduko du ehun ezberdinetan eta garapen-fase desberdinetan. Bere sustatzailearen ekintzaren pean adierazitako RGA-GFP fusioaren degradazioaren bistaratzeak informazio garrantzitsua ematen du sustraietan GA maila osoaren erregulazioari buruz15,16. Hala ere, RGA adierazpena ehunen artean aldatzen da17 eta GA18k erregulatzen du. Beraz, RGA sustatzailearen adierazpen diferentzialak RGA-GFP-rekin ikusitako fluoreszentzia eredua eragin dezake eta, beraz, metodo hau ez da kuantitatiboa. Duela gutxi, fluoreszeina bioaktiboarekin (Fl) etiketatutako GA19,20 agerian utzi zuen GA metaketa sustrai-endokortexean eta bere maila zelularren erregulazioa GA garraioaren bidez. Duela gutxi, GA FRET sentsoreak nlsGPS1-ek erakutsi zuen GA mailak sustraietan, harizpietan eta ilunean hazitako hipokotiloetan zelularen luzapenarekin erlazionatzen direla21. Hala ere, ikusi dugunez, GA kontzentrazioa ez da GA seinaleztapen-jarduera kontrolatzen duen parametro bakarra, sentsazio-prozesu konplexuen araberakoa baita. Hemen, DELLA eta GA seinaleztapen-bideen ulermenean oinarrituta, GA seinaleztapenerako degradazioan oinarritutako biosentsore erraziometriko baten garapena eta karakterizazioa ematen dugu. Biosentsore kuantitatibo hau garatzeko, proteina fluoreszente batekin fusionatu eta ehunetan nonahi adierazten den GA-sentikorra den RGA mutante bat erabili dugu, baita GA-sentikor ez duen proteina fluoreszente bat ere. Erakutsi dugu RGA proteina-fusio mutanteek ez dutela GA seinale endogenoa oztopatzen nonahi adierazten denean, eta biosentsore honek GA sarreraren eta GA seinalearen prozesamenduaren ondoriozko seinale-jarduera kuantifikatu dezakeela detektatzeko aparatuek bereizmen espazio-denbora handikoarekin. Biosentsore hau erabili dugu GA seinaleztapen-jardueraren banaketa espazio-tenporala mapatzeko eta GA-k SAM epidermisaren portaera zelularra nola erregulatzen duen kuantifikatzeko. GAk organo primordioen artean kokatutako SAM zelulen zatiketa-planoaren orientazioa erregulatzen duela frogatzen dugu, eta horrela barne-nodoaren antolakuntza zelular kanonikoa definitzen du.
Azkenik, qmRGAk hazten ari diren hipokotiloak erabiliz GA endogenoen mailaren aldaketak jakinarazi ditzakeen galdetu dugu. Aurretik erakutsi genuen nitratoak hazkuntza estimulatzen duela GA sintesia eta, aldi berean, DELLA34 degradazioa areagotuz. Horren arabera, nitrato-hornidura ugarian hazitako pUBQ10::qmRGA plantuletan (10 mM NO3-) hipokotiloaren luzera nitratorik gabeko baldintzetan hazitako plantuletan baino nabarmen luzeagoa zela ikusi genuen (6a irudi osagarria). Hazkundearen erantzunarekin bat, GA seinaleak handiagoak ziren 10 mM NO3- baldintzetan hazitako plantulen hipokotiloetan nitratorik ezean hazitako plantuletan baino (6b, c irudi osagarria). Horrela, qmRGAk GA kontzentrazioko aldaketa endogenoek eragindako GA seinaleztapenaren aldaketen jarraipena ere ahalbidetzen du.
qmRGA-k detektatu duen GA seinaleztapen-jarduera GA kontzentrazioaren eta GA pertzepzioaren araberakoa den ulertzeko, sentsorearen diseinuaren arabera espero zen moduan, ehun begetatiboetan eta ugalketan dauden hiru GID1 hartzaileen adierazpena aztertu dugu. Plantuletan, GID1-GUS berriemaile-lerroak GID1a eta c oso adierazita zeuden kotiledoietan (3a-c irudia). Horrez gain, hiru errezeptoreak hostoetan, alboko sustrai-primordioetan, sustrai-muturretan (GID1b-ren erro-kapean izan ezik) eta sistema baskularrean adierazi ziren (3a-c irudia). SAM infloreszentzian, GUS seinaleak GID1b eta 1c-etarako soilik detektatu ditugu (7a-c irudi osagarria). In situ hibridazioak adierazpen-eredu hauek baieztatu zituen eta gehiago frogatu zuen GID1c maila baxuetan uniformeki adierazten zela SAM-en, GID1b-k SAMaren periferian adierazpen handiagoa erakutsi zuen (7d-l irudi osagarria). pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b translazio-fusioak GID1b adierazpenaren sorta mailakatua ere agerian utzi zuen, SAMaren erdialdean adierazpen baxua edo eza organoen ertzetan adierazpen altuera arte (7m irudi osagarria). Beraz, GID1 hartzaileak ez daude uniformeki banatuta ehunen artean eta ehunen barruan. Ondorengo esperimentuetan, GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) gainadierazpenak hipokotiloetan qmRGAren sentsibilitatea areagotu zuela ikusi genuen kanpoko GA aplikazioarekiko (3d, e. irudia). Aitzitik, hipokotiloan qd17mRGA-k neurtutako fluoreszentzia ez zen GA3 tratamenduarekiko sentikorra (3f, g irudia). Bi saiakuntzetarako, plantulak GA kontzentrazio handiekin tratatu ziren (100 μM GA3) sentsorearen portaera azkarra ebaluatzeko, non GID1 hartzailearekin lotzeko gaitasuna areagotu edo galdu zen. Emaitza hauek batera, qmRGA biosentsoreak GA eta GA sentsore gisa funtzio konbinatua betetzen duela baieztatzen dute eta GID1 hartzailearen adierazpen diferentzialak sentsorearen emisibitatea modu nabarmenean modulatu dezakeela iradokitzen dute.
Orain arte, SAM-en GA seinaleen banaketa ez dago argi. Hori dela eta, qmRGA adierazteko landareak eta pCLV3::mCherry-NLS zelula amaren berriemailea35 erabili ditugu GA seinaleztapen-jardueraren bereizmen handiko mapa kuantitatiboak kalkulatzeko, L1 geruzan arreta jarriz (epidermisa; 4a, b. irudiak, ikus Metodoak eta metodo osagarriak), L16 hazkuntzaren giltzarria betetzen baitu SAM3 kontrolatzeko. Hemen, pCLV3::mCherry-NLS adierazpenak erreferentzia geometriko finko bat eman zuen GA seinaleztapen-jardueraren banaketa espazio-denborala aztertzeko37. Alboko organoen garapenerako GA ezinbestekotzat jotzen bada ere4, ikusi dugu GA seinaleak baxuak zirela lore-primordioan (P) P3 fasetik hasita (4a, b. irudiak), P1 eta P2 primordio gazteek erdialdeko eskualdekoaren antzeko jarduera moderatua zuten bitartean (4a, b irudiak). GA seinaleztapen-jarduera handiagoa detektatu zen organo-primordioen mugetan, P1/P2-n hasita (mugaren alboetan) eta P4-n gailurra iritsiz, baita primordioen artean kokatutako eskualde periferikoko zelula guztietan ere (4a, b eta 8a, b irudi osagarriak). GA seinaleztapen-jarduera handiagoa epidermisan ez ezik, L2 eta goiko L3 geruzetan ere ikusi zen (8b irudi osagarria). qmRGA erabiliz SAMn atzemandako GA seinaleen eredua ere aldatu gabe mantendu zen denboran (8c-f, k irudi osagarria). Qd17mRGA konstrukzioa T3 landareen SAM-en modu sistematikoan erregulatu bazen ere zehatz-mehatz ezaugarritu ditugun bost lerro independenteetatik, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP eraikuntzarekin lortutako fluoreszentzia-ereduak aztertu ahal izan ditugu (8g-j, l irudi osagarria). Kontrol-lerro honetan, fluoreszentzia-erlazioan aldaketa txikiak baino ez ziren detektatu SAMn, baina SAM zentroan TagBFP-rekin lotutako VENUSen jaitsiera argia eta ustekabekoa ikusi genuen. Horrek baieztatzen du qmRGA-k behatutako seinaleztapen-ereduak mRGA-VENUS-en GA-ren menpeko degradazioa islatzen duela, baina qmRGA-k meristemaren zentroan GA seinaleztapen-jarduera gainestimatu dezakeela ere frogatzen du. Laburbilduz, gure emaitzek primordioen banaketa islatzen duten GA seinaleztapen-eredua erakusten dute. Primordien arteko eskualdearen (IPR) banaketa hau garatzen ari den primordioaren eta erdialdeko eskualdearen artean GA seinaleztapen-jarduera handia pixkanaka ezartzearen ondorioz gertatzen da, eta, aldi berean, primordioko GA seinaleztapen-jarduera gutxitzen da (4c, d irudia).
GID1b eta GID1c hartzaileen banaketak (ikus goian) iradokitzen du GA hartzaileen adierazpen diferentzialak SAM-en GA seinaleztapen-jardueraren eredua moldatzen laguntzen duela. Galdetu genuen ea GA-ren metaketa diferentziala egon zitekeen. Aukera hori ikertzeko, nlsGPS1 GA FRET sentsorea erabili dugu21. Aktibazio-maiztasun handiagoa detektatu zen 10 μM GA4 + 7-rekin tratatutako nlsGPS1 SAM-n 100 minutuz (9a-e irudi osagarria), nlsGPS1-ek SAM-en GA kontzentrazio-aldaketei erantzuten diela adieraziz, sustraietan bezala21. NlsGPS1 aktibazio-maiztasunaren banaketa espazialak GA maila nahiko baxuak agerian utzi zituen SAMen kanpoko geruzetan, baina SAMen erdialdean eta ertzetan altxatuta zeudela erakutsi zuen (4e irudia eta 9a,c irudi osagarria). Horrek iradokitzen du GA SAMn ere banatzen dela qmRGA-k agerian uzten duen eredu espazial batekin. Ikuspegi osagarri gisa, SAM GA fluoreszentearekin (GA3-, GA4-, GA7-Fl) edo Fl bakarrik tratatu dugu kontrol negatibo gisa. Fl seinalea SAM osoan banatu zen, erdialdeko eskualdea eta primordioa barne, intentsitate baxuagoan bada ere (4j irudia eta 10d irudi osagarria). Aitzitik, hiru GA-Fl metatu ziren bereziki primordioko mugen barruan eta gradu ezberdinetan gainerako IPR-n, GA7-Fl IPRko domeinurik handienean pilatu zen (4k irudia eta 10a,b irudi osagarria). Fluoreszentzia-intentsitatearen kuantifikazioak agerian utzi zuen IPR eta ez-IPR intentsitate-erlazioa handiagoa zela GA-Fl tratatutako SAM-n Fl-tratatutako SAM-arekin alderatuta (4l. irudia eta 10c. irudi osagarria). Batera, emaitza hauek iradokitzen dute GA kontzentrazio altuagoetan dagoela organoen mugatik hurbilen dauden IPR zeluletan. Horrek iradokitzen du SAM GA seinaleztapen-jardueraren eredua GA hartzaileen adierazpen diferentzialaren eta GA-ren metaketa diferentzialaren ondoriozkoa dela organoen mugetatik gertu dauden IPR zeluletan. Horrela, gure analisiak GA seinaleztapenaren ustekabeko eredu espazio-denborala agerian utzi zuen, SAMaren erdian eta primordioan jarduera txikiagoarekin eta eskualde periferikoan IPRn jarduera handiagoarekin.
SAM-en GA seinaleztapen-jarduera diferentzialak duen zeregina ulertzeko, GA seinaleztapen-jardueraren, zelulen hedapenaren eta zelulen zatiketaren arteko korrelazioa aztertu dugu SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS denbora errealeko denbora errealeko irudiak erabiliz. GAk hazkundearen erregulazioan duen eginkizuna kontuan hartuta, zelulen hedapen-parametroekin korrelazio positiboa espero zen. Hori dela eta, lehenik eta behin, GA seinaleztapen-jardueraren mapak zelula gainazaleko hazkuntza-tasaren mapekin (zelula jakin baten eta zelula alaben hedapenaren indarraren proxy gisa) eta hazkuntza-anisotropiaren mapekin alderatu genituen, zelularen hedapenaren norabidea neurtzen dutenak (hemen ere erabiltzen da zelula jakin baterako eta zelula alabentzat zatitzean; 5a, b irudiak, ikus Metodoak eta Metodoak). SAM zelulen gainazaleko hazkuntza-tasaren gure mapak aurreko behaketekin bat datoz38,39, mugan hazkunde-tasa minimoekin eta loreen garapen-tasa maximoekin (5a. irudia). Osagai nagusien analisiak (PCA) erakutsi zuen GA seinaleztapenaren jarduera zelulen gainazaleko hazkunde intentsitatearekin negatiboki erlazionatuta zegoela (5c irudia). Era berean, aldakuntza-ardatz nagusiak, GA seinalearen sarrera eta hazkuntza-intentsitatea barne, CLV3 adierazpen altuak zehaztutako norabidearekiko ortogonalak zirela erakutsi genuen, gainerako analisietan SAM zentrotik zelulak baztertu zirela baieztatuz. Spearman-en korrelazio-analisiak PCAren emaitzak berretsi zituen (5d irudia), IPRn GA-seinale altuagoek ez zutela zelulen hedapen handiagoa eragin adieraziz. Hala ere, korrelazio-analisiak GA seinaleztapenaren jardueraren eta hazkuntza anisotropiaren arteko korrelazio positibo apur bat agerian utzi zuen (5c, d irudia), IPRn GA seinale handiagoak zelulen hazkuntzaren norabidean eta ziurrenik zelulen zatiketaren planoaren posizioan eragina duela iradokitzen du.
a, b Azaleko batez besteko hazkuntza (a) eta hazkuntza anisotropiaren (b) bero-mapak SAMn batez beste zazpi landare independentetan (hurrenez hurren zelulen hedapenaren indarraren eta norabidearen proxy gisa erabiltzen dira). c PCA analisiak aldagai hauek barne hartu zituen: GA seinalea, gainazaleko hazkunde intentsitatea, gainazaleko hazkuntza anisotropia eta CLV3 adierazpena. PCA osagaia 1 batez ere negatiboki erlazionatu zen gainazaleko hazkunde intentsitatearekin eta positiboki GA seinalearekin. PCA osagaia 2 batez ere positiboki erlazionatu zen gainazaleko hazkuntza anisotropiarekin eta negatiboki CLV3 adierazpenarekin. Ehunekoek osagai bakoitzak azaltzen duen aldakuntza adierazten dute. d Spearman-en korrelazio-analisia GA seinalearen, gainazaleko hazkuntza-intentsitatearen eta gainazaleko hazkuntzaren anisotropiaren arteko ehunen eskalan, CZ kenduta. Eskuineko zenbakia bi aldagairen arteko Spearman rho balioa da. Asteriskoek korrelazio/korrelazio negatiboa oso esanguratsua den kasuak adierazten dituzte. e Col-0 SAM L1 zelulen 3D bistaratzea mikroskopio konfokalaren bidez. 10 ordutan SAMn (baina ez primordioan) eratutako zelula-horma berriak angelu-balioen arabera margotzen dira. Kolore-barra beheko eskuineko izkinan agertzen da. Txertaketak dagokion 3D irudia erakusten du 0 ordutan. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen antzeko emaitzekin. f Kutxa grafikoek zelula-zatiketa-tasak erakusten dituzte IPRn eta ez-IPR Col-0 SAMn (n = 10 landare independente). Erdiko lerroak mediana erakusten du, eta koadroen mugek 25. eta 75. pertzentilak adierazten dituzte. Biboteek R softwarearekin zehaztutako gutxieneko eta gehienezko balioak adierazten dituzte. P balioak Welch-en bi isatseko t-testarekin lortu ziren. g, h Diagrama eskematikoa erakusten duen (g) nola neurtu zelula horma berriaren (magenta) angelua SAM-aren erdigunetik (puntudun marra zuria) norabide erradialari dagokionez (angelu akutuen balioak, hau da, 0-90°, bakarrik hartzen dira kontuan), eta (h) meristemaren barruko zirkunferentzia/alboko eta erradiala noranzkoak. i SAM (urdin iluna), IPR (urdin ertaina) eta ez-IPR (urdin argia), hurrenez hurren. P balioak Kolmogorov-Smirnov bi isats baten bidez lortu ziren. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen antzeko emaitzekin. j P3 (berde argia), P4 (berde ertaina) eta P5 (berde iluna) inguruan IPRren zelula-zatiketa planoko orientazioaren maiztasun histogramak. P balioak Kolmogorov-Smirnov bi isats baten bidez lortu ziren. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen antzeko emaitzekin.
Hori dela eta, jarraian GA seinaleztapenaren eta zelula-zatiketaren jardueraren arteko korrelazioa ikertu genuen, saiakuntzan zehar sortu berri diren zelula hormak identifikatuz (5e. irudia). Ikuspegi honi esker, zelularen zatiketaren maiztasuna eta norabidea neurtu ahal izan ditugu. Harrigarria bada ere, aurkitu dugu IPRn eta gainerako SAM-eko zelulen zatiketen maiztasuna (IPR ez dena, 5f. irudia) antzekoa zela, eta horrek adierazten du IPR eta IPR ez diren zelulen arteko GA-seinalearen desberdintasunek ez dutela nabarmen eragiten zelulen zatiketa. Horrek eta GA seinaleztapenaren eta hazkuntza anisotropiaren arteko korrelazio positiboak GA seinaleztapenaren jarduerak zelularen zatiketa-planoaren orientazioan eragina izan dezakeen aztertzera bultzatu gintuzten. Zelula horma berriaren orientazioa meristemaren zentroa eta zelula-horma berriaren erdigunea lotzen dituen ardatz erradialarekiko angelu zorrotz gisa neurtu genuen (5e-i. irudia) eta zelulek ardatz erradialarekiko 90°-tik gertuko angeluetan banatzeko joera argia ikusi genuen, maiztasun altuenak 70-80°-% 2. 2. 2. 9° eta % 2. 2. 2 . (5e,i irud.), zirkunferentzia/zeharkako norabidean zelularen zatiketei dagokiena (5h. irud.). GA seinaleak zelula-zatiketa-jokabide horri egiten dion ekarpena aztertzeko, zelula-zatiketa-parametroak IPRn eta ez-IPRan bereizita aztertu genituen (5i. irudia). IPR zeluletan zatiketa angeluaren banaketa desberdina zela IPR zeluletan edo SAM osoko zeluletan, IPR zelulek alboko/zirkulu-zatiketen proportzio handiagoa erakusten zuten, hau da, 70-80° eta 80-90° (% 33,86 eta % 30,71, hurrenez hurren, dagozkion proportzioak). Horrela, gure behaketek GA seinaleztapen altuaren eta zirkunferentziaren norabidetik hurbil dagoen zelula-zatiketa-planoaren orientazioaren arteko asoziazioa agerian utzi zuten, GA seinaleztapen-jardueraren eta hazkuntza anisotropiaren arteko korrelazioaren antzekoa (5c, d irudia). Elkarte honen kontserbazio espaziala gehiago finkatzeko, P3tik hasita primordioa inguratzen duten IPR zeluletan zatiketa-planoaren orientazioa neurtu genuen, P4tik hasita eskualde honetan GA seinaleztapen-jarduera handiena detektatu baitzen (4. irudia). P3 eta P4 inguruan IPRren zatiketa angeluek ez zuten desberdintasun estatistikorik esanguratsurik erakutsi, nahiz eta alboko zelulen zatiketa maiztasun handiagoa izan P4 inguruko IPRn (5j. irudia). Hala ere, P5 inguruko IPR zeluletan, zelula-zatiketa-planoaren orientazio-aldea estatistikoki esanguratsua bihurtu zen, zeharkako zelulen zatiketen maiztasuna handitu zen (5j. irudia). Batera, emaitza hauek iradokitzen dute GA seinaleak SAM-en zelula-zatiketen orientazioa kontrolatu dezakeela, eta hori bat dator aurreko txostenekin40,41 GA-seinale altuak IPRn zelula-zatiketen alboko orientazioa eragin dezakeela.
Aurreikusten da IPRko zelulak ez direla primordioetan sartuko, baizik eta barnekodeetan2,42,43. IPR-ko zelula-zatiketen zeharkako orientazioak zelula epidermikoen luzetarako lerro paraleloen antolaketa tipikoa eragin dezake internodoetan. Goian deskribatutako gure behaketek iradokitzen dute GA seinaleak prozesu honetan zeresana izango duela ziurrenik zelulen zatiketaren norabidea erregulatuz.
DELLA gene batzuen funtzio galerak GA erantzun eratzailea dakar, eta della mutanteak erabil daitezke hipotesi hori probatzeko44. Lehenik eta behin, SAM-en bost DELLA geneen adierazpen-ereduak aztertu genituen. GUS lerroaren transkripzio-fusioak agerian utzi zuen GAI, RGA, RGL1 eta RGL2 (askoz neurri txikiagoan) SAMn adierazi zirela (11a-d irudi osagarria). In situ hibridazioak gehiago frogatu zuen GAI mRNA bereziki primordioetan eta garatzen ari diren loreetan metatzen dela (11e irudi osagarria). RGL1 eta RGL3 mRNA SAM kanoiko osoan eta lore zaharretan detektatu ziren, eta RGL2 mRNA ugariagoa zen mugako eskualdean (11f-h irudi osagarria). pRGL3::RGL3-GFP SAM-en irudi konfokalak in situ hibridazioaren bidez ikusitako adierazpena berretsi zuen eta RGL3 proteina SAMaren erdiko zatian pilatzen dela erakutsi zuen (11i irudi osagarria). pRGA::GFP-RGA lerroa erabiliz, RGA proteina SAM-en pilatzen dela ere aurkitu dugu, baina bere ugaritasuna murrizten da P4tik hasita mugan (11j irudi osagarria). Nabarmentzekoa, RGL3 eta RGA-ren adierazpen-ereduak bat datoz IPRn GA seinaleztapen-jarduera handiagoarekin, qmRGA-k detektatu bezala (4. irudia). Gainera, datu horiek adierazten dute DELLA guztiak SAMn adierazten direla eta haien adierazpenak SAM osoa hartzen duela kolektiboki.
Jarraian, basati-mota SAM (Ler, kontrola) eta gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 mutante quintuple (global)-en (6a, b irudia) zelulen zatiketa parametroak aztertu ditugu. Interesgarria da, estatistikoki esanguratsua den aldaketa zelula-zatiketa angelu-frekuentzien banaketan della global mutante SAM-n mota basatiarekin alderatuta (6c. irudia). Della global mutantearen aldaketa hau 80-90°-ko angeluen (% 34,71 vs. 24,55) eta, neurri txikiagoan, 70-80°-ko (% 23,78 vs. 20,18) angeluen (% 23,78 vs. 20,18) maiztasuna (% 34,71 vs. 24,55). Zeharkako zatiketen maiztasuna (0-60°) ere txikiagoa zen della global mutantean (6c. irudia). Zelulen zatiketa zeharkakoen maiztasuna nabarmen handitu zen della global mutantearen SAMn (6b. irudia). IPRn zeharkako zelulen zatiketen maiztasuna ere handiagoa izan zen della global mutantean basatiarekin alderatuta (6d. irudia). IPR eskualdetik kanpo, basa motak zelulen zatiketa angeluen banaketa uniformeagoa zuen, della mutante globalak IPR bezalako zatiketa tangentzialak hobetsi zituen (6e. irudia). Gainera, ga2 oxidasa (ga2ox) mutante boskoten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 eta ga2ox6-2) SAM-an zelula-zatiketen orientazioa kuantifikatu dugu, GA metatzen den GA-inaktiboen hondo mutante bat. GA mailen igoerarekin bat etorriz, ga2ox infloreszentzia mutante boskotearen SAM Col-0arena baino handiagoa zen (12a, b irudi osagarria), eta Col-0-rekin alderatuta, ga2ox SAM boskoteek zelula-zatiketa-angeluen banaketa desberdina erakutsi zuten, angelu-maiztasuna handituz joan zen 50°-tik, zatiketa tangentzialetik berriro 90°-ra igotzen zen. 12a–c irudia). Horrela, GA seinaleztapenaren aktibazio eratzaileak eta GA metaketak alboko zelulen zatiketak eragiten dituela erakusten dugu IPRn eta gainerako SAMetan.
a, b PIz tindatutako Ler (a) eta global della mutant (b) SAM L1 geruzaren 3D bistaratzea mikroskopia konfokala erabiliz. 10 orduko epean SAMn (baina ez primordioan) eratutako zelula-horma berriak erakusten eta koloreztatzen dira haien angelu-balioen arabera. Txertatuan SAM erakusten da 0 h. Kolore-barra beheko eskuineko izkinan bistaratzen da. (b) geziak mutante globalaren lerrokatutako gelaxka fitxategien adibide bat adierazten du. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen antzeko emaitzekin. Ler eta global della arteko zelula-zatiketa planoko orientazioen maiztasun-banaketaren konparaketa SAM (d), IPR (e) eta ez-IPR (f) osoan. P balioak Kolmogorov-Smirnov bi isats baten bidez lortu ziren. f, g Col-0 (i) eta pCUC2::gai-1-VENUS (j) landare transgenikoen PIz tindatutako SAMen irudi konfokalen 3D bistaratzea. Panelek (a, b) 10 orduko epean SAMn eratutako zelula horma berriak (baina ez primordioak) erakusten dituzte. Esperimentua bi aldiz errepikatu zen antzeko emaitzekin. h–j Col-0 eta pCUC2::gai-1-VENUS landareen artean SAM (h), IPR (i) eta ez-IPR (j) osoan kokatutako zelula-zatiketa planoko orientazioen maiztasun-banaketaren konparaketa. P balioak Kolmogorov-Smirnov bi isats baten bidez lortu ziren.
Ondoren, GA seinaleztapena IPRn zehazki inhibitzearen eragina probatu genuen. Horretarako, cotyledon cup 2 (CUC2) sustatzailea erabili dugu VENUSekin fusionatutako gai-1 proteina negatibo nagusi baten adierazpena bultzatzeko (pCUC2::gai-1-VENUS lerroan). SAM basatian, CUC2 sustatzaileak SAM-ko IPR gehienen adierazpena bultzatzen du, mugako zelulak barne, P4tik aurrera, eta antzeko adierazpen espezifikoa ikusi zen pCUC2::gai-1-VENUS landareetan (ikus behean). pCUC2::gai-1-VENUS landareen zelula-zatiketa-angeluen banaketa ez zen oso desberdina basa-motatik, nahiz eta ustekabean aurkitu genuen landare horietan IPRrik gabeko zelulak 80-90°-ko maiztasun handiagoan banatzen zirela (6f-j irudia).
Zelulen zatiketaren norabidea SAMaren geometriaren araberakoa dela iradoki da, bereziki ehunen kurbadurak sortzen duen trakzio-esfortzuaren araberakoa46. Horregatik, SAM-en forma aldatu ote zen della global mutantean eta pCUC2::gai-1-VENUS landareetan. Aurretik jakinarazi bezala12, della SAM mutante globalaren tamaina basatiarena baino handiagoa zen (13a, b, d irudi osagarria). CLV3 eta STM RNA-ren in situ hibridazioak della mutanteen meristemaren hedapena baieztatu zuen eta, gainera, zelula amaren nitxoaren alboko hedapena erakutsi zuen (13e, f, h, i irudi osagarria). Hala ere, SAM kurbadura antzekoa zen bi genotipoetan (13k, m, n, p irudi osagarria). Gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della mutante laukoitzean tamaina antzeko hazkundea ikusi dugu basatiarekin alderatuta kurbadura aldaketarik gabe (13c, d, g, j, l, o, p irudi osagarria). Zelula-zatiketa-orientazioaren maiztasuna della mutante laukoitzean ere eragina izan zuen, baina della mutante monolitikoan baino neurri txikiagoan (12d-f irudi osagarria). Dosi-efektu honek, kurbaduran eraginik ez izatearekin batera, Della mutante laukoitzean hondar RGL3 jarduerak DELLA jardueraren galerak eragindako zelulen zatiketaren orientazio-aldaketak mugatzen dituela eta alboko zelulen zatiketa-aldaketak gertatzen direla GA seinaleztapen-jardueraren aldaketei erantzunez SAM geometriaren aldaketetan baino. Goian deskribatu bezala, CUC2 sustatzaileak IPR adierazpena gidatzen du SAM-n P4tik hasita (14a, b irudi osagarria), eta, aitzitik, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM-ek tamaina murriztua zuen baina kurbadura handiagoa zuen (14c-h irudi osagarria). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiaren aldaketa honek tentsio mekanikoen banaketa desberdina eragin dezake basatiarekin alderatuta, zeinetan zirkunferentzia handiko tentsioak SAM zentrotik distantzia laburragoan hasten diren47. Bestela, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiaren aldaketak transgeneen adierazpenak eragindako eskualdeko propietate mekanikoen aldaketen ondorioz izan daitezke48. Bi kasuetan, honek GA seinaleztapenaren aldaketen ondorioak partzialki konpentsatu ditzake zelulak zirkunferentzia/zeharkako orientazioan banatzeko probabilitatea handituz, gure behaketak azalduz.
Batera hartuta, gure datuek baieztatzen dute GA-seinale handiagoak rol aktiboa duela IPRn zelula-zatiketa-planoaren alboko orientazioan. Era berean, meristemaren kurbadurak IPRn zelularen zatiketa-planoaren orientazioan ere eragiten duela erakusten dute.
IPRn zatiketa-planoaren zeharkako orientazioak, GA seinaleztapen-jarduera handia dela eta, iradokitzen du GAk zelula erradial-fitxategi bat aurretiaz antolatzen duela epidermisan SAM barruan gero epidermisaren barne-nodoan aurkituko den antolakuntza zelularra definitzeko. Izan ere, horrelako zelula-fitxategiak maiz ikusten ziren della global mutanteen SAM irudietan (6b. irudia). Horrela, SAMn GA seinaleztapenaren patroi espazialaren garapen-funtzioa gehiago aztertzeko, time-lapse irudia erabili dugu IPR-ko zelulen antolakuntza espaziala aztertzeko basatietan (Ler eta Col-0), della global mutanteetan eta pCUC2::gai-1-VENUS landare transgenikoetan.
qmRGA-k IPRn GA seinaleztapen-jarduera P1/P2-tik gora egin zuela eta P4-n goia jo zuela erakutsi zuen, eta eredu hori konstante mantendu zen denboran zehar (4a-f irudia eta 8c-f irudi osagarria, k). IPRko zelulen antolakuntza espaziala GA seinalea gero eta handiagoarekin aztertzeko, Ler IPR zelulak P4ren gainetik eta alboetara etiketatu ditugu, lehen behaketa egin eta 34 ordura aztertutako garapen-patuaren arabera, hau da, bi plastido-denbora baino gehiago, IPR zelulak P1/P2-ra P4-ra bitarteko garapenean jarraitu ahal izateko. Hiru kolore ezberdin erabili genituen: horia P4 ondoan primordioan integratuta zeuden zelulentzat, berdea IPRn zeudenentzat eta morea bi prozesuetan parte hartu zutenentzat (7a-c. irudia). T0-n (0 h), IPR zelulen 1-2 geruza ikusten ziren P4ren aurrean (7a. irudia). Espero zen bezala, zelula horiek zatitu zirenean, batez ere zeharkako zatiketa planoaren bidez egiten zuten (7a-c. irudiak). Antzeko emaitzak Col-0 SAM erabiliz lortu ziren (P3-n zentratuz, zeinaren ertza P4-ren antzera tolesten baita Ler-en), nahiz eta genotipo honetan lore-ertzean sortutako tolesturak IPR zelulak azkarrago ezkutatu zituen (7g-i. irudia). Horrela, IPR zelulen zatiketa-ereduak zelulak ilara erradialetan antolatzen ditu aldez aurretik, barne-nodoetan bezala. Errenkada erradialen antolaketak eta IPR zelulak ondoz ondoko organoen artean kokatzeak iradokitzen du zelula hauek progenitore internodalak direla.
Hemen, GA seinaleztapen-biosentsore ratiometriko bat garatu dugu, qmRGA, GA eta GA hartzaileen kontzentrazio konbinatuen ondoriozko GA seinaleztapen-jardueraren mapa kuantitatiboa ahalbidetzen duena, seinaleztapen-bide endogenoekin interferentziak minimizatzen dituen bitartean, zelula mailan GA funtzioari buruzko informazioa emanez. Horretarako, DELLA proteina eraldatu bat eraiki dugu, mRGA, DELLA interakzio-kideak lotzeko gaitasuna galdu duena baina GAk eragindako proteolisiarekiko sentikorra izaten jarraitzen duena. qmRGAk GA mailen aldaketa exogenoei eta endogenoei erantzuten die, eta bere sentsazio-propietate dinamikoek garapenean zehar GA seinaleztapen-jardueraren aldaketa espazio-denboralak ebaluatzen dituzte. qmRGA ere oso tresna malgua da, ehun ezberdinetara egokitu daitekeelako bere adierazpenerako erabiltzen den sustatzailea aldatuz (beharrezkoa bada), eta GA seinaleztapen-bidearen eta angiospermoen PFYRE motiboaren izaera kontserbatua kontuan hartuta, litekeena da beste espezie batzuetara transferigarria izatea22. Horrekin bat etorriz, arrozaren SLR1 DELLA proteinaren (HYY497AAA) mutazio baliokide batek SLR1-en hazkuntza-errepresio-jarduera kentzen zuela ere frogatu zen GA bidezko degradazioa apur bat murrizten zuen bitartean, mRGA23-ren antzera. Aipagarria da Arabidopsis-en egindako azken ikerketek PFYRE domeinuan (S474L) aminoazido bakarreko mutazio batek RGAren transkripzio-jarduera aldatu zuela transkripzio-faktoreen bazkideekin elkarreragiteko duen gaitasunari eragin gabe50. Mutazio hau mRGAn dauden 3 aminoazido ordezkapenetatik oso hurbil dagoen arren, gure ikerketek erakusten dute bi mutazio hauek DELLAren ezaugarri desberdinak aldatzen dituztela. Transkripzio-faktore-kide gehienak DELLA26,51-en LHR1 eta SAW domeinuetara lotzen diren arren, PFYRE domeinuko aminoazido kontserbatu batzuek elkarrekintza hauek egonkortzen lagun dezakete.
Nodoen garapena landareen arkitekturan eta etekinaren hobekuntzan funtsezko ezaugarria da. qmRGAk GA seinaleztapen-jarduera handiagoa agerian utzi zuen IPR barneko zelulen progenitoreetan. Irudi kuantitatiboak eta genetika konbinatuz, GA seinaleztapen-ereduek SAM epidermisan zelula-zatiketa zirkular/zeharkako planoak gainjartzen dituztela erakutsi genuen, barne-nodoen garapenerako beharrezkoa den zelula-zatiketa-antolamendua moldatzen dutela. Garapenean zehar zelularen zatiketa-planoaren orientazioaren hainbat erregulatzaile identifikatu dira52,53. Gure lanak GA seinaleztapenaren jarduerak parametro zelular hau nola erregulatzen duen erakusten du. DELLA aurrez tolesturiko proteina-konplexuekin elkarreragin dezake41, beraz, GA seinaleak zelulen zatiketa planoaren orientazioa erregulatu dezake mikrotubulu kortikalen orientazioa zuzenean eraginez40,41,54,55. Ustekabean erakutsi genuen SAM-en, GA seinaleztapen-jarduera handiagoaren korrelazioa ez zela zelulen luzapena edo zatiketa, hazkuntza anisotropia baizik, hau da, GAk IPRn zelulen zatiketaren norabidean duen eragin zuzenarekin bat datorrena. Hala ere, ezin dugu baztertu efektu hori zeharkakoa ere izan daitekeenik, adibidez GAk eragindako zelulen horma leuntzearen bitartez56. Zelularen hormaren propietateen aldaketek estres mekanikoa eragiten dute57,58, eta horrek ere eragin dezake zelulen zatiketa-planoaren orientazioan, mikrotubulu kortikalen orientazioari eraginez39,46,59. GAk eragindako estres mekanikoaren eta GA-k mikrotubuluen orientazioaren erregulazio zuzenaren efektu konbinatuak IPRn zelula-zatiketa-orientazio-eredu espezifiko bat sortzean parte hartu dezakete, barne-nodoak definitzeko, eta ikerketa gehiago behar dira ideia hori probatzeko. Era berean, aurreko ikerketek DELLArekin elkarreraginean dauden TCP14 eta 15 proteinen garrantzia nabarmendu dute internodoen eraketaren kontrolean60,61 eta faktore hauek GAren ekintzaren bitartekaritza izan dezakete BREVIPEDICELLUS (BP) eta PENNYWISE (PNY) batera, entrenodoen garapena erregulatzen duten eta GA seinaleztapenean eragina dutela frogatu da2,62. DELLA-ek brassinosteroideak, etilenoak, azido jasmonikoak eta azido abszisikoak (ABA) seinaleztapen-bideekin elkarreragiten dutela63,64 eta hormona horiek mikrotubuluen orientazioan eragina izan dezaketela65, GAk zelulen zatiketa-orientazioan dituen ondorioak beste hormonek ere eragin ditzakete.
Lehen azterketa zitologikoek erakutsi zuten Arabidopsis SAM-en barruko zein kanpoko eskualdeak beharrezkoak direla entrenodoen garapenerako2,42. Izan ere, GAk barne-ehunetako zelulen zatiketa aktiboki erregulatzen duela12, GAren funtzio bikoitza onartzen du SAM-en meristemaren eta barne-nodoen tamaina erregulatzeko. Norabidezko zelulen zatiketaren eredua ere estu araututa dago barruko SAM ehunean, eta erregulazio hori ezinbestekoa da zurtoinaren hazkuntzarako52. Interesgarria izango da aztertzea GAk zelula-zatiketa-planoa SAM barneko antolakuntzan orientatzeko ere zereginik betetzen duen, horrela SAM-en barne-nodoen zehaztapena eta garapena sinkronizatzeko.
Landareak in vitro lurzoruan hazi ziren edo 1x Murashige-Skoog (MS) medio (Duchefa) % 1 sakarosa eta % 1 agar (Sigma) baldintza estandarretan (16 h argi, 22 °C), hipokotilo eta sustraien hazkuntza esperimentuetan izan ezik, non plantulak plaka bertikaletan hazi ziren argi etengabean eta 22 °C-tan. Nitratoen esperimentuetarako, landareak eraldatutako MS ingurunean (bioWORLD landare-euskarrian) hazi ziren nitrato egokiarekin (0 edo 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, %1 sakarosa eta %1 A-agar (Sigma) egun luzeko baldintzetan.
pDONR221-en txertatutako GID1a cDNA pDONR P4-P1R-pUBQ10 eta pDONR P2R-P3-mCherry-rekin birkonbinatu zen pB7m34GW-n pUBQ10::GID1a-mCherry sortzeko. pDONR221-en txertatutako IDD2 DNA pB7RWG266-n birkonbinatu zen p35S:IDD2-RFP sortzeko. pGID1b::2xmTQ2-GID1b sortzeko, GID1b kodetze eskualdearen goialdean dagoen 3,9 kb-ko zati bat eta GID1b cDNA (1,3 kb) eta terminatzailea (3,4 kb) dituen 4,7 kb-ko zati bat anplifikatu ziren lehenik 3. taula osagarriko primerrak erabiliz eta ondoren pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) eta pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) bektoreetan sartu ziren, hurrenez hurren, eta azkenik pDONR221 2xmTQ268-rekin birkonbinatu ziren pGreen 012567 helburu bektorean Gateway klonazioa erabiliz. pCUC2::LSSmOrange sortzeko, CUC2 sustatzaile-sekuentzia (ATG-tik gora 3229 bp), eta ondoren Stokes-shifted mOrange handiaren kodetze-sekuentzia (LSSmOrange)69 N7 lokalizazio nuklearraren seinalearekin eta NOS transkripzio-terminatzailearekin, pGreen kanamizina bideratzeko bektorean muntatu ziren Gateway 3 zatikiko birkonbinazio sistema (Invitrogen) erabiliz. Landare-bektore bitarra Agrobacterium tumefaciens GV3101 anduian sartu zen eta Nicotiana benthamiana hostoetan Agrobacterium infiltrazio-metodoaren bidez eta Arabidopsis thaliana Col-0-n lore-murgiltze-metodoaren bidez, hurrenez hurren. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry eta pCLV3::mCherry-NLS qmRGA gurutzaketen F3 eta F1 ondorengoetatik isolatu ziren, hurrenez hurren.
RNA in situ hibridazioa egin zen gutxi gorabehera 1 cm-ko luzera duten kimu-puntetan72, eta berehala FAA disoluzioan (% 3,7 formaldehidoa, % 5 azido azetikoa, % 50 etanola) aurrez hoztutako 4 °C-tan finkatu ziren. 2 × 15 minutu hutsean tratamenduen ondoren, finkatzailea aldatu eta laginak gau osoan inkubatu ziren. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 eta RGL3 cDNAk eta haien 3′-UTRekiko zentzuaren aurkako zundak sintetizatu ziren 3. Taula Osagarrian agertzen diren lehengaiak erabiliz, Rosier et al.73-ek deskribatutako moduan. Digoxigeninaz markatutako zundak immunodetektatu ziren digoxigeninaren antigorputzak erabiliz (3000 aldiz diluzioa; Roche, katalogo-zenbakia: 11 093 274 910), eta atalak 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfatoarekin (BCIP, 250-t-tr-zolium, 250-dilution) tindu ziren. 200 aldiz diluzioa) disoluzioa.
Argitalpenaren ordua: 2025-Otsailaren 10a