Ikerketa honetan, tratamendu konbinatuaren efektu estimulatzaileaklandareen hazkuntza-erregulatzaileak*Hypericum perforatum* L.-n in vitro morfogenesian eta bigarren mailako metabolitoen ekoizpenean (2,4-D eta kinetina) eta burdin oxido nanopartikulen (Fe₃O₄-NP) eragina ikertu zen. Tratamendu optimizatuak [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] landareen hazkuntza-parametroak nabarmen hobetu zituen: landarearen altuera % 59,6 handitu zen, sustraien luzera % 114,0, kimuen kopurua % 180,0 eta kaluaren pisu freskoa % 198,3, kontrol-taldearekin alderatuta. Tratamendu konbinatu honek birsorkuntza-eraginkortasuna ere hobetu zuen (% 50,85) eta hiperizina-edukia % 66,6 handitu zuen. GC-MS analisiak hiperosido, β-patoleno eta zetil alkohol eduki handiak agerian utzi zituen, gailurraren azalera osoaren % 93,36 osatuz, fenoliko eta flavonoide guztien edukia, berriz, % 80,1era arte handitu zen. Emaitza hauek adierazten dute landareen hazkuntza-erregulatzaileek (PGR) eta Fe₃O₄ nanopartikulek (Fe₃O₄-NP) efektu sinergikoa dutela organogenesia eta konposatu bioaktiboen metaketa estimulatuz, eta hori estrategia itxaropentsua da landare sendagarrien hobekuntza bioteknologikorako.
San Joan lorea (Hypericum perforatum L.), San Joan lorea izenez ere ezaguna, Hypericaceae familiako landare belarkara iraunkorra da, balio ekonomikoa duena.[1] Bere osagai bioaktibo potentzialen artean tanino naturalak, xantonak, florogluzinola, naftalenodiantrona (hiperina eta pseudohiperina), flavonoideak, azido fenolikoak eta olio esentzialak daude.[2,3,4] San Joan lorea metodo tradizionalen bidez heda daiteke; hala ere, metodo tradizionalen sasoikotasunak, hazien ernetze baxuak eta gaixotasunekiko sentikortasunak mugatzen dute eskala handiko laborantzarako eta bigarren mailako metabolitoen etengabeko eraketarako duen potentziala.[1,5,6]
Beraz, in vitro ehunen kultura landareen hedapen azkarra, germoplasma baliabideak kontserbatzeko eta konposatu sendagarrien etekina handitzeko metodo eraginkortzat hartzen da [7, 8]. Landareen hazkuntza erregulatzaileek (PGR) funtsezko zeregina dute morfogenesia erregulatzeko eta beharrezkoak dira kaluaren eta organismo osoen in vitro hazkuntzarako. Haien kontzentrazioak eta konbinazioak optimizatzea ezinbestekoa da garapen prozesu horiek arrakastaz burutzeko [9]. Beraz, erregulatzaileen konposizio eta kontzentrazio egokia ulertzea garrantzitsua da San Joan lorearen (H. perforatum) hazkuntza eta birsorkuntza gaitasuna hobetzeko [10].
Burdin oxido nanopartikulak (Fe₃O₄) ehunen kulturarako garatu diren edo garatzen ari diren nanopartikula klase bat dira. Fe₃O₄-k propietate magnetiko esanguratsuak, biobateragarritasun ona eta landareen hazkundea sustatzeko eta ingurumen-estresa murrizteko gaitasuna ditu, beraz, arreta handia erakarri du ehunen kultura-diseinuetan. Nanopartikula hauen aplikazio potentzialen artean, in vitro kultura optimizatzea egon daitezke zelulen zatiketa sustatzeko, mantenugaien xurgapena hobetzeko eta antioxidatzaileen entzimak aktibatzeko [11].
Nanopartikulek landareen hazkuntzan sustapen-efektu onak erakutsi dituzten arren, Fe₃O₄ nanopartikulen eta landareen hazkuntza-erreguladore optimizatuen *H. perforatum*-en aplikazio konbinatuaren inguruko ikerketak urriak dira oraindik. Ezagutza-hutsune hori betetzeko, ikerketa honek in vitro morfogenesian eta bigarren mailako metabolitoen ekoizpenean duten efektu konbinatuaren ondorioak ebaluatu zituen, landare sendagarrien ezaugarriak hobetzeko ikuspegi berriak emateko. Beraz, ikerketa honek bi helburu ditu: (1) landareen hazkuntza-erreguladoreen kontzentrazioa optimizatzea kalu-eraketa, kimuen birsorkuntza eta sustraiak in vitro sustatzeko; eta (2) Fe₃O₄ nanopartikulen hazkuntza-parametroetan in vitro duten eragina ebaluatzea. Etorkizuneko planen artean, birsortutako landareen biziraupen-tasa ebaluatzea dago, aklimatazioan (in vitro). Ikerketa honen emaitzek *H. perforatum*-en mikrohedapen-eraginkortasuna nabarmen hobetzea espero da, eta horrela, landare sendagarri garrantzitsu honen erabilera jasangarriari eta aplikazio bioteknologikoei lagunduz.
Ikerketa honetan, urteroko San Joan lore landareen (ama landareen) hosto-explanteak lortu genituen. Explante hauek in vitro hazkuntza-baldintzak optimizatzeko erabili ziren. Hazkuntza egin aurretik, hostoak ondo garbitu ziren ur destilatu korrontearen azpian hainbat minutuz. Ondoren, explanteen gainazalak desinfektatu ziren % 70eko etanolean 30 segundoz murgilduz, eta ondoren Tween 20 tanta batzuk zituen % 1,5eko sodio hipoklorito (NaOCl) disoluzio batean 10 minutuz murgilduz. Azkenik, explanteak hiru aldiz garbitu ziren ur destilatu esterilarekin, hurrengo hazkuntza-ingurunera eraman aurretik.
Hurrengo lau asteetan, kimuen birsorkuntza-parametroak neurtu ziren, besteak beste, birsorkuntza-tasa, explante bakoitzeko kimu kopurua eta kimuaren luzera. Birsortutako kimuek gutxienez 2 cm-ko luzera lortu zutenean, erdi-kontzentrazioko MS medioz, 0,5 mg/L azido indolebutirikoz (IBA) eta % 0,3ko guar gomaz osatutako sustrai-ingurune batera eraman ziren. Sustraien kultura hiru astez jarraitu zen, eta denbora horretan sustrai-tasa, sustraien kopurua eta sustraien luzera neurtu ziren. Tratamendu bakoitza hiru aldiz errepikatu zen, errepikapen bakoitzeko 10 explante landuz, tratamendu bakoitzeko 30 explante inguru lortuz.
Landarearen altuera zentimetrotan (cm) neurtu zen erregela bat erabiliz, landarearen oinarritik hosto altuenaren puntaraino. Sustraien luzera milimetrotan (mm) neurtu zen, plantulak arretaz kendu eta hazkuntza-ingurunea kendu ondoren. Explant bakoitzeko kimu kopurua zuzenean zenbatu zen landare bakoitzean. Hostoetan dauden orban beltzen kopurua, nodulu izenekoa, bisualki neurtu zen. Nodulu beltz hauek hiperizina edo orban oxidatiboak dituzten guruinak direla uste da, eta landareak tratamenduarekiko duen erantzunaren adierazle fisiologiko gisa erabiltzen dira. Hazkuntza-ingurune guztia kendu ondoren, plantulen pisu freskoa miligramo (mg) zehaztasuneko balantza elektroniko bat erabiliz neurtu zen.
Kaloaren eraketa-tasa kalkulatzeko metodoa honako hau da: hainbat hazkuntza-erregulatzaile (kinasak, 2,4-D eta Fe3O4) dituen ingurune batean explanteak lau astez landu ondoren, kaloa sortzeko gai diren explanteen kopurua zenbatzen da. Kaloaren eraketa-tasa kalkulatzeko formula honako hau da:
Tratamendu bakoitza hiru aldiz errepikatu zen, gutxienez 10 explante aztertuz errepikapen bakoitzean.
Birsorkuntza-tasak kalu-formazio fasearen ondoren kimu-bereizketa prozesua arrakastaz burutzen duen kalu-ehunaren proportzioa islatzen du. Adierazle honek kalu-ehunak ehun bereizi bihurtzeko eta landare-organo berrietan hazteko duen gaitasuna erakusten du.
Sustraitze-koefizientea sustraiak botatzeko gai diren adar kopuruaren eta adar kopuru osoaren arteko erlazioa da. Adierazle honek sustraitze-fasearen arrakasta islatzen du, eta hori funtsezkoa da mikrohedapenean eta landareen hedapenean, sustraitze onak landareei hazkuntza-baldintzetan hobeto bizirauten laguntzen baitie.
Hiperizina konposatuak % 90eko metanolarekin erauzi ziren. Berrogeita hamar mg landare-material lehor gehitu zitzaizkion 1 ml metanol eta 20 minutuz sonikatu zen 30 kHz-tan ultrasoinu-garbigailu batean (A5120-3YJ modeloa) giro-tenperaturan eta iluntasunean. Sonikazioaren ondoren, lagina 6000 rpm-tan zentrifugatu zen 15 minutuz. Gainnatzailea bildu zen, eta hiperizinaren xurgapena 592 nm-tan neurtu zen Plus-3000 S espektrofotometro bat erabiliz, Conceiçao et al.-ek deskribatutako metodoaren arabera [14].
Landareen hazkuntza-erregulatzaileekin (PGR) eta burdin oxido nanopartikulekin (Fe₃O₄-NP) egindako tratamendu gehienek ez zuten nodulu beltzen eraketa eragin birsortutako kimu-hostoetan. Ez zen nodulurik ikusi 0,5 edo 1 mg/L 2,4-D, 0,5 edo 1 mg/L kinetina, edo 1, 2 edo 4 mg/L burdin oxido nanopartikulekin egindako tratamenduetan. Konbinazio batzuek nodulu-garapenean igoera txiki bat erakutsi zuten (baina ez estatistikoki esanguratsua) kinetina eta/edo burdin oxido nanopartikulen kontzentrazio handiagoetan, hala nola 2,4-D (0,5–2 mg/L) kinetinarekin (1–1,5 mg/L) eta burdin oxido nanopartikulekin (2–4 mg/L) konbinazioan. Emaitza hauek 2. irudian ageri dira. Nodulu beltzek hiperizinaz aberatsak diren guruinak adierazten dituzte, biak naturalki agertzen direnak eta onuragarriak. Ikerketa honetan, nodulu beltzak batez ere ehunen marroitzearekin lotuta zeuden, hiperizina metatzeko ingurune egokia adieraziz. 2,4-D, kinetina eta Fe₃O₄ nanopartikulekin egindako tratamenduak kaluaren hazkuntza sustatu zuen, marroitzea murriztu zuen eta klorofila edukia handitu zuen, funtzio metaboliko hobea eta kalte oxidatiboaren murrizketa potentziala iradokiz [37]. Ikerketa honek kinetinak 2,4-D eta Fe₃O₄ nanopartikulekin konbinatuta San Joan lorearen kaluaren hazkuntzan eta garapenean dituen efektuak ebaluatu zituen (3a-g irudiak). Aurreko ikerketek erakutsi dute Fe₃O₄ nanopartikulek onddoen aurkako eta antimikrobiano jarduerak dituztela [38, 39] eta, landareen hazkuntza erregulatzaileekin konbinatuta erabiltzen direnean, landareen defentsa mekanismoak estimulatu eta zelulen estres indizeak murriztu ditzaketela [18]. Bigarren mailako metabolitoen biosintesia genetikoki erregulatuta dagoen arren, haien benetako etekina ingurumen-baldintzen menpe dago neurri handi batean. Aldaketa metaboliko eta morfologikoek bigarren mailako metabolitoen mailetan eragina izan dezakete landare-gene espezifikoen adierazpena erregulatuz eta ingurumen-faktoreei erantzunez. Gainera, induzitzaileek gene berrien aktibazioa eragin dezakete, eta horrek, aldi berean, jarduera entzimatikoa estimulatzen du, azken finean hainbat bide biosintetiko aktibatuz eta bigarren mailako metabolitoen eraketa eraginez. Beste ikerketa batek erakutsi zuen itzala murrizteak eguzki-argiaren esposizioa handitzen duela, eta horrela eguneko tenperaturak igotzen dituela *Hypericum perforatum*-en habitat naturalean, eta horrek hiperizinaren etekina handitzen ere laguntzen duela. Datu hauetan oinarrituta, ikerketa honek burdin nanopartikulen eginkizuna ikertu zuen ehunen kulturan induzitzaile potentzial gisa. Emaitzek erakutsi zuten nanopartikula hauek hesperidinaren biosintesian parte hartzen duten geneak aktibatu ditzaketela estimulazio entzimatikoaren bidez, konposatu horren metaketa areagotuz (2. irudia). Beraz, baldintza naturaletan hazten diren landareekin alderatuta, argudia daiteke konposatu horien ekoizpena in vivo ere hobetu daitekeela estres moderatua bigarren mailako metabolitoen biosintesian parte hartzen duten geneen aktibazioarekin konbinatzen denean. Konbinazio-tratamenduek, oro har, eragin positiboa dute birsorkuntza-tasan, baina kasu batzuetan, efektu hori ahuldu egiten da. Azpimarratzekoa da 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinasa eta kontzentrazio desberdinekin egindako tratamenduak birsorkuntza-tasa % 50,85 handitu zezakeela modu independentean eta nabarmen kontrol-taldearekin alderatuta (4c irudia). Emaitza hauek iradokitzen dute nanohormonei buruzko konbinazio espezifikoek modu sinergikoan jardun dezaketela landareen hazkundea eta metabolitoen ekoizpena sustatzeko, eta hori oso garrantzitsua da sendabelarren ehunen kulturarako. Palmer eta Keller-ek [50] erakutsi zuten 2,4-D tratamenduak modu independentean eragin zezakeela kaluaren eraketa St. perforatum-en, eta kinasa gehitzeak, berriz, nabarmen hobetu zituen kaluaren eraketa eta birsorkuntza. Efektu hau hormona-oreka hobetzearen eta zelulen zatiketaren estimulazioaren ondoriozkoa izan zen. Bal et al. [51] aurkitu zuten Fe₃O₄-NP tratamenduak modu independentean hobetu zezakeela antioxidatzaileen entzimen funtzioa, eta horrela sustraien hazkundea sustatu St. perforatum-en. 0,5 mg/L, 1 mg/L eta 1,5 mg/L-ko kontzentrazioetan Fe₃O₄ nanopartikulak dituzten kultura-inguruneek liho-landareen birsorkuntza-tasa hobetu zuten [52]. Kinetinaren, 2,4-diklorobenzotiazolinonaren eta Fe₃O₄ nanopartikulen erabilerak kailuaren eta sustraien eraketa-tasak nabarmen hobetu zituen, baina hormona hauek in vitro birsorkuntzarako erabiltzearen albo-ondorio potentzialak kontuan hartu behar dira. Adibidez, 2,4-diklorobenzotiazolinonaren edo kinetinaren epe luzeko edo kontzentrazio handiko erabilerak aldakuntza klonal somatikoa, estres oxidatiboa, kailuaren morfologia anormala edo bitrifikazioa eragin ditzake. Beraz, birsorkuntza-tasa altu batek ez du zertan egonkortasun genetikoa iragarri. Birsortutako landare guztiak markatzaile molekularrak (adibidez, RAPD, ISSR, AFLP) edo analisi zitogenetikoa erabiliz ebaluatu behar dira, in vivo landareekiko homogeneotasuna eta antzekotasuna zehazteko [53,54,55].
Ikerketa honek lehen aldiz frogatu du landareen hazkuntza-erreguladoreak (2,4-D eta kinetina) Fe₃O₄ nanopartikulekin konbinatzeak morfogenesia eta metabolito bioaktibo gakoen (hiperizina eta hiperosidoa barne) metaketa hobetu dezakeela *Hypericum perforatum*-en. Tratamendu-erregimen optimizatuak (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetina + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) ez ditu soilik kaluaren eraketa, organogenesia eta bigarren mailako metabolitoen etekina maximizatu, baizik eta efektu induzitzaile arina ere erakutsi du, landarearen estres-tolerantzia eta balio sendagarria hobetuz. Nanoteknologiaren eta landare-ehunen kulturaren konbinazioak plataforma jasangarri eta eraginkorra eskaintzen du konposatu sendagarriak in vitro ekoizteko eskala handian. Emaitza hauek bidea zabaltzen dute aplikazio industrialetarako eta etorkizuneko ikerketarako mekanismo molekularrei, dosi-optimizazioari eta zehaztasun genetikoari buruz, eta horrela, sendabelarren inguruko oinarrizko ikerketa bioteknologia praktikoarekin lotzen du.
Argitaratze data: 2025eko abenduak 12