N,N-dietil-m-toluamida sendagai antihelmintikoa (DEET) AChE (azetilkolinesterasa) inhibitzen duela jakinarazi da eta propietate kartzinogenikoak izan ditzakeela gehiegizko baskularizazioagatik. Artikulu honetan, erakusten dugu DEETek angiogenesia sustatzen duten zelula endotelialak estimulatzen dituela bereziki, eta horrela tumoreen hazkundea handitzen duela. DEETek angiogenesia eragiten duten prozesuak aktibatzen ditu, besteak beste, ugalketa, migrazioa eta atxikimendua. Hori NO ekoizpena eta VEGF espresioa handitzearekin lotuta dago zelula endotelialetan. M3 isilarazteak edo M3 inhibitzaile farmakologikoak erabiltzeak efektu horiek guztiak ezabatzen ditu, eta horrek iradokitzen du DEETek eragindako angiogenesia M3-rekiko sentikorra dela. M3 hartzaileak gehiegi adierazten dituzten zelula endotelial eta HEK zeluletan kaltzioaren seinaleztapena duten esperimentuek, baita lotura eta ainguratze ikerketek ere, adierazten dute DEETek M3 hartzaileen modulatzaile alosteriko gisa jokatzen duela. Gainera, DEETek AChE inhibitzen du, eta horrela azetilkolinaren bioerabilgarritasuna eta M3 hartzaileekiko lotura handituz, eta efektu proangiogenikoak hobetuz erregulazio alosterikoaren bidez.
EC primarioak Suitzako saguen aortatik isolatu ziren. Erauzketa-metodoa Kobayashi protokolotik egokitu zen 26. Saguen ECak EBM-2 medioan landu ziren, % 5eko FBS bero-inaktibatuarekin osatua, laugarren pasabidera arte.
DEET bi kontzentraziok HUVEC, U87MG edo BF16F10-en ugalketan duten eragina CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) erabiliz aztertu zen. Laburbilduz, putzu bakoitzeko 5.103 zelula erein ziren 96 putzuko plaka batean, gau osoan zehar itsasten utzi ziren eta ondoren DEET-ekin tratatu ziren 24 orduz. Hazkuntza-ingurunea kendu ondoren, gehitu koloratzaile lotzaile-soluzioa mikroplakaren putzu bakoitzera eta inkubatu zelulak 37 °C-tan 30 minutuz. Fluoreszentzia-mailak Mithras LB940 mikroplaka multimodu irakurgailu bat (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) erabiliz zehaztu ziren, 485 nm-ko kitzikapen-iragazkiekin eta 530 nm-ko emisio-iragazkiekin hornitua.
HUVECak 96 putzuko plaketan erein ziren, putzu bakoitzeko 10⁴ zelulako dentsitatearekin. Zelulak DEET-rekin tratatu ziren 24 orduz. Zelulen bideragarritasuna MTT analisi kolorimetriko bat erabiliz ebaluatu zen (Sigma-Aldrich, M5655). Dentsitate optikoaren balioak mikroplaka irakurgailu multimodal batean (Mithras LB940) lortu ziren, 570 nm-ko uhin-luzeran.
DEETaren efektuak in vitro angiogenesi analisiak erabiliz aztertu ziren. 10-8 M edo 10-5 M DEETarekin egindako tratamenduak kapilarreen luzeraren eraketa handitu zuen HUVECetan (1a, b irudiak, barra zuriak). Kontrol-taldearekin alderatuta, 10-14 eta 10-5 M arteko DEET kontzentrazioekin egindako tratamenduak erakutsi zuen kapilarreen luzerak goi-ordoki batera iritsi zela 10-8 M DEET-tan (S2 irudi osagarria). Ez zen desberdintasun esanguratsurik aurkitu DEETarekin tratatutako HUVECen in vitro efektu proangiogenikoan 10-8 M eta 10-5 M-ko kontzentrazio-tartean.
DEETak neobaskularizazioan duen eragina zehazteko, in vivo neobaskularizazio-azterketak egin genituen. 14 egun igaro ondoren, 10-8 M edo 10-5 M DEETekin aldez aurretik landutako zelula endotelialak injektatu zitzaizkien saguei hemoglobina-edukia nabarmen handitu zitzaien (1c irudia, barra zuriak).
Gainera, DEETek eragindako neobaskularizazioa aztertu zen U87MG xenograft-dun saguetan, eta egunero (ip) DEET injektatu zitzaien 10-5 M-ko plasma-kontzentrazioak eragiten dituela ezagutzen den dosian, eta hori normala da gizaki esposiziodunetan. 23an. Detektagarriak diren tumoreak (hau da, >100 mm3-ko tumoreak) ikusi ziren U87MG zelulak saguetan injektatu eta 14 egunera. 28. egunean, tumoreen hazkundea nabarmen handitu zen DEETekin tratatutako saguetan kontrol-saguekin alderatuta (1d irudia, karratuak). Gainera, tumoreen CD31 tindaketak erakutsi zuen DEETek kapilar-azalera nabarmen handitzen zuela, baina ez mikrohodien dentsitatea. (1e-g irudiak).
DETAk eragindako ugalketan hartzaile muskarinikoen eginkizuna zehazteko, 10-8 M edo 10-5 M DETA erabili zen pFHHSiD-ren aurrean (10-7 M, M3 hartzaileen antagonista selektiboa). HUVEC-en tratamendua. pFHHSiD-k DETA-ren ugalketa-propietateak erabat blokeatu zituen kontzentrazio guztietan (1. taula).
Baldintza hauetan, DEETek HUVEC zeluletan kapilarren luzera handituko ote zuen ere aztertu genuen. Era berean, pFHHSiD-k DEETek eragindako kapilarren luzera nabarmen eragotzi zuen (1a, b irudia, barra grisak). Gainera, antzeko esperimentuak egin ziren M3 siRNArekin. Kontrol-siRNA ez zen eraginkorra kapilar-eraketa sustatzeko, baina M3 hartzaile muskarinikoaren isilarazteak DEETek kapilarren luzera handitzeko duen gaitasuna ezabatu zuen (1a, b irudia, barra beltzak).
Gainera, in vitro 10-8 M edo 10-5 M DEETek eragindako baskularizazioa eta in vivo neobaskularizazioa erabat blokeatu zituen pFHHSiD-k (1c irudia, d, zirkuluak). Emaitza hauek adierazten dute DEETek angiogenesia sustatzen duela M3 hartzaileen antagonista selektiboekiko edo M3 siRNArekiko sentikorra den bide baten bidez.
AChE DEETen jomuga molekularra da. Donepezil bezalako sendagaiek, AChE inhibitzaile gisa jarduten dutenek, EC angiogenesia estimula dezakete in vitro eta saguen atzeko gorputz-adarretako iskemia ereduetan14. DEETen bi kontzentraziok AChE entzimaren jardueran duten eragina probatu genuen HUVECetan. DEETen kontzentrazio baxuek (10-8 M) eta altuek (10-5 M) AChE endoteliarraren jarduera gutxitu zuten kontrol-baldintzekin alderatuta (2. irudia).
DEETen bi kontzentrazioek (10-8 M eta 10-5 M) azetilkolinesterasaren jarduera murriztu zuten HUVECen gainean. BW284c51 (10-5 M) erabili zen azetilkolinesterasaren inhibitzaileen kontrol gisa. Emaitzak DEETen bi kontzentrazioekin tratatutako HUVECen gainean AChE jardueraren ehuneko gisa adierazten dira, ibilgailuarekin tratatutako zelulekin alderatuta. Balioak sei esperimentu independenteren batez besteko ± SEM gisa adierazten dira. *p < 0,05 kontrolarekin alderatuta (Kruskal-Wallis eta Dunn-en konparazio anitzeko testa).
Oxido nitrikoa (NO) prozesu angiogenikoan parte hartzen du 33, beraz, DEET-ekin estimulatutako HUVEC-etan NO ekoizpena aztertu zen. DEET-ekin tratatutako NO endotelialaren ekoizpena handitu egin zen kontrol-zelulekin alderatuta, baina 10-8 M-ko dosian bakarrik lortu zuen esanguratsutasuna (3c irudia). DEET-ek eragindako NO ekoizpena kontrolatzen duten aldaketa molekularrak zehazteko, eNOS adierazpena eta aktibazioa Western blotting bidez aztertu ziren. DEET tratamenduak ez zuen eNOS adierazpena aldatu, baina nabarmen handitu zuen eNOS fosforilazioa bere aktibazio-gunean (Ser-1177), bere inhibizio-gunean (Thr-495) gutxituz, eNOS fosforilazioan tratatu gabeko zelulekin alderatuta (3d irudia). Gainera, aktibazio-gunean eta inhibizio-gunean fosforilatutako eNOSaren erlazioa kalkulatu zen, fosforilatutako eNOS kopurua entzimaren kopuru osoarekiko normalizatu ondoren. Proportzio hau nabarmen handitu zen DEET kontzentrazio bakoitzarekin tratatutako HUVEC-etan tratatu gabeko zelulekin alderatuta (3d irudia).
Azkenik, VEGFren adierazpena, faktore proangiogeniko nagusietako bat, Western blotting bidez aztertu zen. DEETek VEGFren adierazpena nabarmen handitu zuen, pFHHSiD-k, berriz, adierazpen hori erabat blokeatu zuen.
DEETaren efektuak bloke farmakologikoarekiko eta M3 hartzaileen beheranzko erregulazioarekiko sentikorrak direnez, DEETak kaltzioaren seinaleztapena hobetu dezakeen hipotesia probatu genuen. Harrigarria bada ere, DEETak ez zuen HUVEC-en (datuak ez dira erakusten) eta HEK/M3-n (4a eta b irudiak) zitoplasmako kaltzioa handitzea lortu erabilitako bi kontzentrazioetarako.
Argitaratze data: 2024ko abenduaren 30a