N,N-dietil-m-toluamida sendagai antihelmintikoa (DEET) AChE (acetilkolinesterasa) inhibitzen duela eta propietate kartzinogeno potentzialak ditu gehiegizko baskularizazioa dela eta. Artikulu honetan, DEETek angiogenesia sustatzen duten zelula endotelialak bereziki estimulatzen dituela erakusten dugu, eta horrela tumorearen hazkundea areagotzen du. DEETek angiogenesia eragiten duten prozesu zelularrak aktibatzen ditu, ugaltzea, migrazioa eta atxikimendua barne. Hau zelula endotelialetan NO ekoizpena eta VEGF espresioa areagotzearekin lotzen da. M3 isiltzeak edo M3 inhibitzaile farmakologikoak erabiltzeak efektu horiek guztiak deuseztatu zituen, DEETek eragindako angiogenesia M3arekiko sentikorra dela iradokiz. M3 errezeptoreen gainespresatzen duten endotelio eta HEK zeluletan kaltzioaren seinaleztapena inplikatzen duten esperimentuek, baita lotze- eta atrakatze-ikerketek ere, DEET-ek M3 hartzaileen modulatzaile alosteriko gisa jokatzen duela adierazten dute. Gainera, DEETek AChE inhibitzen du, horrela azetilkolinaren bioerabilgarritasuna eta M3 errezeptoreekin lotzea areagotuz, eta efektu proangiogenikoak areagotuz erregulazio alosterikoaren bidez.
EC primarioak Suitzako saguen aortatik isolatu ziren. Erauzketa metodoa Kobayashi protokolotik 26 egokitu zen. Murine ECak EBM-2 euskarri batean hazi ziren % 5 beroarekin inaktibatuta dagoen FBSrekin osatutako laugarren pasabidera arte.
DEETen bi kontzentrazioek HUVEC, U87MG edo BF16F10 ugaltzean duten eragina CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) erabiliz aztertu zen. Laburbilduz, putzu bakoitzeko 5.103 zelula hazi ziren 96 putzuko plaka batean, gauean lotzen utzi eta, ondoren, DEETarekin tratatu ziren 24 orduz. Hazkuntza-euskarria kendu ondoren, gehitu tindagai lotzeko soluzioa mikroplaken putzu bakoitzean eta inkubatu zelulak 37 °C-tan 30 minutuz. Fluoreszentzia-mailak 485 nm-ko kitzikapen-iragazkiekin eta 530 nm-ko igorpen-iragazkiekin hornitutako Mithras LB940 mikroplaken irakurgailuaren (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) modu anitzeko irakurgailu baten bidez zehaztu ziren.
HUVEC 96 putzuko plaketan hazi ziren putzu bakoitzeko 104 zelula dentsitatearekin. Zelulak DEETarekin tratatu ziren 24 orduz. Zelulen bideragarritasuna MTT saiakuntza kolorimetriko baten bidez ebaluatu zen (Sigma-Aldrich, M5655). Dentsitate optikoaren balioak modu anitzeko mikroplaken irakurgailu batean lortu ziren (Mithras LB940) 570 nm-ko uhin-luzeran.
DEETen ondorioak in vitro angiogenesi saiakuntzak erabiliz aztertu ziren. 10-8 M edo 10-5 M DEET-ekin tratamenduak HUVEC-en luzera kapilarren eraketa handitu zuen (1a, b irudiak, barra zuriak). Kontrol taldearekin alderatuta, 10-14 eta 10-5 M bitarteko DEET kontzentrazioekin egindako tratamenduak erakutsi zuen luzera kapilarra 10-8 M DEET-eko lautadara iritsi zela (S2 irudi osagarria). Ez da alde handirik aurkitu DEETekin tratatutako HUVECen in vitro efektu proangiogenikoan 10-8 M eta 10-5 M-ko kontzentrazio tartean.
DEETek neobaskularizazioan duen eragina zehazteko, in vivo neobaskularizazioaren azterketak egin genituen. 14 egun igaro ondoren, 10-8 M edo 10-5 M DEET-ekin aurrelaboratutako zelula endotelialekin injektatutako saguek hemoglobina edukiaren igoera nabarmena izan zuten (1c. irudia, barra zuriak).
Gainera, DEET-ek eragindako neobaskularizazioa aztertu zen egunero (ip) DEETarekin injektatzen zuten U87MG xenoinjertodun saguetan 10-5 M-ko plasma-kontzentrazioa eragiten duten dosi batean, eta hori normala da jasandako gizakietan. urtean 23. Tumore detektagarriak (hau da, tumoreak > 100 mm3) saguetan U87MG zelulak injektatu eta 14 egunera ikusi ziren. 28. egunean, tumorearen hazkundea nabarmen hobetu zen DEET-ekin tratatutako saguetan kontroleko saguekin alderatuta (1d. irudia, laukiak). Gainera, tumoreen CD31 tindaketak erakutsi zuen DEETek nabarmen handitu zuela kapilar eremua baina ez mikrohodien dentsitatea. (1e–g. irudia).
DETAk eragindako ugalketan errezeptore muskarinikoek duten eginkizuna zehazteko, 10-8 M edo 10-5 M DETA pFHHSiD-ren presentzian (10-7 M, M3 hartzaileen antagonista selektiboa) erabili zen. HUVECen tratamendua. pFHHSiD-k erabat blokeatu zituen DETAren propietate proliferatiboak kontzentrazio guztietan (1. taula).
Baldintza horietan, DEETek HUVEC zeluletan kapilarren luzera handituko ote zuen ere aztertu genuen. Era berean, pFHHSiD-ek DEETek eragindako luzera kapilarra eragotzi zuen nabarmen (1a, b. irudiak, barra grisak). Gainera, antzeko esperimentuak egin ziren M3 siRNArekin. Kontrol siRNA kapilarren eraketa sustatzeko eraginkorra izan ez arren, M3 muskarinikoaren hartzailea isiltzeak DEET-ek kapilarren luzera handitzeko gaitasuna ezabatu zuen (1a, b, barra beltzak irudiak).
Gainera, 10-8 M edo 10-5 M DEETek eragindako baskularizazioa in vitro eta neobaskularizazioa in vivo pFHHSiD-ek erabat blokeatu zituen (1c, d, zirkuluak). Emaitza hauek adierazten dute DEETek angiogenesia sustatzen duela M3 hartzaileen antagonista selektiboekiko edo M3 siRNAekiko sentikorra den bide baten bidez.
AChE DEETen helburu molekularra da. AChE inhibitzaile gisa jarduten duten donepezil bezalako sendagaiek EC angiogenesia in vitro eta saguaren atzeko iskemia ereduetan estimula dezakete14. DEETen bi kontzentrazioek AChE entzimaren jardueran duten eragina probatu dugu HUVECen. DEETen kontzentrazio baxuak (10-8 M) eta altuek (10-5 M) AChE endotelialaren jarduera gutxitu zuten kontrol baldintzekin alderatuta (2. irudia).
DEETen bi kontzentrazioek (10-8 M eta 10-5 M) azetilkolinesterasaren jarduera murriztu zuten HUVECen. BW284c51 (10-5 M) azetilkolinesterasa inhibitzaileen kontrol gisa erabili zen. Emaitzak DEETen bi kontzentrazioekin tratatutako HUVECen AChE jardueraren ehuneko gisa adierazten dira ibilgailuekin tratatutako zelulekin alderatuta. Balioak sei esperimentu independenteren batez besteko ± SEM gisa adierazten dira. *p < 0,05 kontrolarekin alderatuta (Kruskal-Wallis eta Dunn konparazio anitzeko proba).
Oxido nitrikoa (NO) prozesu angiogenikoan parte hartzen du 33, beraz, DEET-ek estimulatutako HUVECetan NO ekoizpena aztertu zen. DEET-ekin tratatutako NO endotelialaren ekoizpena areagotu egin zen kontrol-zelulekin alderatuta, baina 10-8 M-ko dosiarekin soilik lortu zuen garrantzia (3c. irudia). DEETek eragindako NO ekoizpena kontrolatzen duten aldaketa molekularrak zehazteko, eNOS adierazpena eta aktibazioa Western blotting bidez aztertu ziren. DEET tratamenduak eNOS adierazpena aldatu ez zuen arren, eNOS fosforilazioa nabarmen handitu zuen bere gune aktibatzeko (Ser-1177) bere gune inhibitzailea (Thr-495) gutxitu zuen bitartean eNOS fosforilazioan tratatu gabeko zelulekin alderatuta (3d. irudia). Gainera, aktibazio guneko eNOS fosforilatuaren eta gune inhibitzaileen erlazioa eNOS fosforilatuaren kopurua entzimaren kopuru osoa normalizatu ondoren kalkulatu zen. Ratio hori nabarmen handitu zen DEET kontzentrazio bakoitzarekin tratatutako HUVECetan, tratatu gabeko zelulekin alderatuta (3d. irudia).
Azkenik, VEGFren adierazpena, faktore proangiogeniko nagusietako bat, Western blotting bidez aztertu zen. DEETek nabarmen handitu zuen VEGF adierazpena, eta pFHHSiD-k erabat blokeatu zuen adierazpen hori.
DEETen ondorioak M3 errezeptoreen blokeo farmakologikoarekin eta beheranzko erregulazioarekin sentikorrak direnez, DEETek kaltzioaren seinaleztapena hobetu dezakeen hipotesia probatu dugu. Harrigarria bada ere, DEETek ez zuen kaltzio zitoplasmatikoa handitu HUVEC-en (datuak ez dira agertzen) eta HEK/M3-n (4a, b irudiak) erabilitako bi kontzentrazioetarako.
Argitalpenaren ordua: 2024-12-30