Pestizidek funtsezko zeregina dute munduko elikagai-eskasia konpontzeko eta bektoreek transmititzen dituzten giza gaixotasunen aurka borrokatzeko. Hala ere, pestiziden erresistentziaren arazo gero eta handiagoak premiazkoa eskatzen du gutxi erabiltzen diren helburuei zuzendutako konposatu berriak aurkitzea. Intsektuen errezeptore potentzial iragankorreko (TRPV) kanalek —Nanzhong (Nan) eta inaktiboak (Iav)— kanal heterologoak (Nan-Iav) sor ditzakete eta intsektuen geotropismoa, entzumena eta propiozepzioa bitartekatzen dituzten organo mekanosentsorialetan lokaliza daitezke. Pestizida batzuek, hala nola afidopirrolidonak (AP), Nan-Iav-ri zuzendutako mekanismo ezezagunen bidez egiten dute. AP eraginkorra da intsektu zulatzaile-xurgatzaileen (hemipteroen) aurka, elikadura eragotziz filamentuen funtzioa etenez. AP Nan-era bakarrik lotu daiteke, baina Nan-Iav-ek bakarrik elkarreragin dezake agonistekin, nikotinamida endogenoa (NAM) barne, eta horrela kanal-jarduera erakusten du. Nan-Iav-ek intsektizida-helburu gisa duen potentziala izan arren, gutxi dakigu bere kanal-muntaketari, erregulazio-lotura-guneei eta Ca2+-menpeko erregulazioari buruz, eta horrek intsektiziden garapen gehiago oztopatzen du. Ikerketa honetan, krio-mikroskopia elektronikoa erabili zen Nan-Iav-en egitura zehazteko, kalmulina-ligando gabeko egoeran dauden Hemiptera intsektuetan, baita AP eta NAM ere, ankirina errepikapen zitoplasmako domeinuaren (ARD) mugan daudenean. Harrigarria bada ere, aurkitu genuen Nan proteinak berak pentamero bat osa dezakeela, eta hau AP-k bitartekatutako ARD interakzioek egonkortzen dute. Ikerketa honek intsektiziden eta agonisten eta Nan-Iav-en arteko elkarrekintza molekularrak agerian uzten ditu, ARD-en garrantzia azpimarratuz kanalaren funtzioan eta muntaketan, eta Ca2+ erregulazioaren mekanismoa aztertuz.
Mundu mailako klima-aldaketa gero eta larriagoa den testuinguruan, munduko elikagaien segurtasunaren okerrera XXI. mendeko erronka nagusietako bat da, eta ondorio handiak ditu gizartearentzat.1,2Osasunaren Mundu Erakundearen Elikagaien Segurtasun eta Nutrizioaren Egoerari buruzko Munduko 2023ko (SOFI) txostenak kalkulatzen du mundu osoko 2.330 milioi pertsona inguruk elikagaien segurtasun eza moderatua edo larria jasaten dutela, aspaldiko arazoa.3,4Zoritxarrez, kalkulatzen da urtero uztaren % 20tik % 30era edo gehiago galtzen dela izurrite eta patogenoen ondorioz, eta berotze globalak izurriteen erresistentzia eta laboreen zaurgarritasuna areagotuko dituela espero da.4,5,6,7,8Pestiziden garapena ezinbestekoa da ez bakarrik laboreak izurriteetatik babesteko eta bektoreek kutsatutako patogenoen hedapena murrizteko, baita bektoreek kutsatutako gizakien gaixotasunei aurre egiteko ere, hala nola dengue sukarra, malaria eta Chagas gaixotasuna, gero eta erresistenteagoak baitira pestizidekiko.5,9,10,11
Intsektizida neurotoxikoen jomuga nagusien artean, Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) TRPV kanal heterotetramerikoa azken hamarkadan aurkitutako intsektizida jomuga klase bat da, imidakloprid eta piraklostrobina bezalako merkataritzan eskuragarri dauden intsektizidak barne.12,13,14Afidopirrolifeno (AP) intsektizida erdisintetikoa duela gutxi garatu eta merkaturatu den produktua da, eta bere osagai nagusia Inscalis® intsektizida aktiboa da, AP-ri jarduera-maila subnanomolarrean lotzen zaiona.15AP-k toxikotasun akutua txikia erakusten du polinizatzaileentzat, intsektu onuragarrientzat eta helburu ez diren beste organismo batzuentzat, eta etiketako argibideen arabera erabiltzen denean, beste intsektizidekiko erresistentzia-presioa murriztu dezake.16,17,18Nan eta Iav intsektu espezieetan banatuta daude, antena eta gorputz-adarretako korda-luzapen hartzaile neuronetan bakarrik adierazten dira, eta ezinbestekoak dira entzumenerako, grabitatearen pertzepziorako eta propriozepziorako.13,16,19,20,21,22AP-k, imidaklopridak eta piraklostrobinak Nan-Iav konplexua estimulatzen dute mekanismo berezi baten bidez, azken finean propriozepzio-seinaleen transdukzioa inhibituz.13,16,23Intsektu zulatzaile eta xurgatzen dutenetan (hemipteroak), hala nola afidoetan eta euli zurietan, propiozepzioaren galerak haien elikadura-gaitasuna kaltetzen du, eta azkenean heriotza eragiten du.13,24Interesgarria da AP-ak afinitate handia duela Nan-Iav konplexuarekiko eta afinitate baxua Nan bakarrikarekiko. AP Nan-Iav-era lotzeak korronte elektrikoa eragiten du, baina Nan-era bakarrik lotzeak ez du kanalaren jarduera estimulatzen. Iav berak ez dio batere lotzen AP-ari.16Honek iradokitzen du Nan eta Iav-ek Nan-Iav kanal konplexu desberdinak osatzeko lotu daitezkeela (adibidez, erlazio estekiometriko desberdinekin edo erlazio estekiometriko beraren barruan antolamendu desberdinekin) edo AP hainbat gunetara lotu daitekeela. Gainera, nikotinamida agonista naturalak (NAM) Drosophila Nan-Iav-i afinitate mikromolarrarekin lotzen zaio, in vitro afidoen (AP) antzeko efektuak erakutsiz.16,25eta afidoen ugalketa eta elikadura inhibitzen ditu, azkenean haien heriotza eraginez25,26Datu hauek galdera asko sortzen dituzte. Adibidez, ez dago argi nola sortzen den Nan-Iav heterodimeroa, zein lotura-gune erabiltzen diren molekula txikiak modulatzeko eta nola erregulatzen duten molekula txiki hauek kanalaren funtzioa propiozepzioa kenduz. Gainera, ez dago argi zergatik den Nan bera inaktibo eta APrekiko afinitate txikia duen, eta Nan-Iav heterodimeroa, berriz, aktiboa den eta APrekiko afinitate handiagoarekin lotzen den. Azkenik, gutxi dakigu Nan-Iav funtzioaren Ca2+-menpeko erregulazioari buruz eta nola integratzen den neurona-seinalizazio prozesuetan.13,21
Ikerketa honetan, krio-mikroskopia elektronikoa, elektrofisiologia eta erradioligandoen lotura-teknikak konbinatuz, Nan-Iav-en muntaketa eta molekula txikien erreguladoreei lotzeko mekanismoa argitu dugu. Gainera, Iav-i eta AP-egonkortutako Nan pentameroei lotutako kalmodulina (CaM) detektatu dugu. Emaitza hauek kanaletan kaltzio ioien erregulazioari, kanalen muntaketari eta ligandoen lotura-afinitatea zehazten duten faktoreei buruzko informazio garrantzitsua ematen dute. Garrantzitsuagoa dena, ARD-k zeregin garrantzitsua betetzen duela baieztatu dugu prozesu hauetan. Intsektuen kanal osoen gure ikerketa, nekazaritzako pestizida garrantzitsuei lotutakoa.27, 28, 29pestiziden industriaren garapenerako aukerak irekitzen ditu, pestiziden eraginkortasuna eta espezifikotasuna hobetuz, eta TRPV-ri zuzendutako konposatuak beste espezie batzuetan aplikatzea ahalbidetuz, munduko elikagaien segurtasuna eta bektoreek transmititzen dituzten gaixotasunen hedapena konpontzeko.
Halaber, aurkitu genuen Nan-Iav Ca2+-k erregulatzen duela, eta erregulazio-mekanismoa CaM konstitutiboak bitartekatzen duela. Garrantzitsua da, CaM-k Nav-en Ca2+-ren menpeko erregulazio hau beste ioi-kanalen erregulazio-mekanismoetatik (adibidez, tentsio-menpeko Na+ kanalak eta TRPV5/6 kanalak) nabarmen desberdina dela.52,53,54,55,56,57Nav1.2 kanalean, CaM-ren C-terminal domeinua C-terminal domeinuarekin (CTD) helizeki lotzen da, eta Ca2+-k bere N-terminal domeinua CTD-ren zati distalera lotzea eragiten du.56TRPV5/6 kanalean, CaM-ren C-terminal domeinua CTH-ri lotzen zaio, eta Ca2+-k bere N-terminal domeinuaren goranzko hedapena eragiten du poroan, eta horrela katioien iragazkortasuna blokeatzen du.53,54Nan-Iav-CaM-ren Ca2+-k erregulatutako funtzioaren eredu bat proposatzen dugu (4h irudia). Eredu honetan, CaM-ren N-terminal domeinua Iav-ren C-terminal domeinuari (CTH) lotzen zaio modu konstitutiboan. Atseden egoeran ([Ca2+] kontzentrazio baxua), CaM-ren C-terminal domeinuak Nan-ekin elkarreragiten du, ARD konformazioa egonkortuz eta, horrela, kanalaren irekiera sustatuz. Agonista/intsektizida bat kanalera lotzeak poroen irekiera eragiten du, eta horrek Ca2+ sarrera eragiten du. Ondoren, Ca2+ CaM-ri lotzen zaio, C-terminal domeinua Nan-en ARD-tik bereiziz. CaM lotura blokeatzeak Ca2+-ren inhibizio efektua funtsean ezabatzen duenez, disoziazio honek ARD mugikortasuna modulatzen du, eta horrela, Ca2+-ren menpeko inhibizioa edo desensibilizazioa eragiten du. Kaltzio ioien eluzioaren ondoren kanal-korronteen berreskuratze azkarrak (4g irudia) iradokitzen du mekanismo honek Ca2+-k eragindako neurona-seinaleei erantzun azkarrak errazten dituela. Gainera, Iav-en C-terminal eskualdeak, oraindik ere gaizki ulertzen denak, beste zeregin batzuk ere betetzen dituela jakinarazi da kanalen zuzenketan eta egungo erregulazioan.21
Azkenik, gure ikerketak nekazaritzarako garrantzia duen intsektizida-intsektizida TRP kanal konplexu baten bereizmen handiko egitura aurkezten du —aurkikuntza hori lehenago ezezaguna zitzaigun—. Aipagarria da intsektu-kanalaren egitura eta funtzioa gizakien zeluletan (HEK293S GnTi–) karakterizatu ditugula, intsektu-zeluletan baino. Intsektiziden erresistentzia gero eta handiagoaren eta elikagaien segurtasunaren eta patogenoen gaineko presio etengabearen aurrean, gure lanak informazio garrantzitsua eskaintzen du, giza osasunaren eta elikagaien segurtasun globalaren onurarako intsektizida berrien garapena erraztuko duena. Ikerketek erakutsi dute AP bezalako intsektizidak eraginkorrak direla izurrite batzuen aurka, etiketako argibideen arabera erabiltzen direnean, eta toxikotasun akutu txikia dutela polinizatzaile onuragarrientzat, ingurumen-segurtasuna erakutsiz.13,16Gainera, AP deribatu batzuk eltxoetan egindako probek erakutsi dute azkenean hegan egiteko gaitasuna galtzen dutela. Konposatu modulatzaile hauek Nan-Iav-era nola lotzen diren ulertzeak konposatu daudenen aldaketa edo konposatu berriak garatzea erraztuko du, eraginkorragoak eta eraginkorragoak izan daitezen.zehatzaIzurriteen kontrola. Gure ikerketak erakusten du Nan-Iav ARD interfazea ez dela soilik konposatu endogenoen, pestiziden eta Ca2+-CaM-en jarduera erregulatzeko, baita kanalen muntaketarako ere. Iradokitzen dugu heterodimeroen muntaketa molekula txikiekin etetea ioi kanalen inhibitzaileak garatzeko ikuspegi paregabe eta itxaropentsua izan daitekeela.
Zortzi gene ortologoetatik, kakalardo marroiaren (Halyomorpha halys) Nanchung eta Inactive gene osoak hautatu ziren, detergenteetan egonkortasun bikaina erakutsiz. Sintetizatutako geneak kodon-optimizatu ziren gizakien adierazpenerako eta pBacMam pCMV-DEST bektorean klonatu ziren (Life Technologies) XhoI eta EcoRI murrizketa guneak erabiliz. Horrek ziurtatu zuen klonak C-terminal GFP-FLAG-10xHis eta mCherry-FLAG-10xHis etiketekin marko berean zeudela, eta hauek HRC-3C proteasak (PPX) ebakitzen ditu, eta horrek aukera ematen du independenteki...adierazpenNanchung eta Inactive pBacMam bektorean klonatzeko erabilitako primerrak hauek izan ziren:
Partikula indibidualen irudi mikroskopikoak Titan Krios G2 transmisio-mikroskopio elektroniko (FEI) batean lortu ziren, K3 kamera batekin eta Gatan BioQuantum energia-iragazki batekin hornitua. Mikroskopioa 300 keV-tan erabili zen, 20 eV-ko energia-ezarpenarekin, 1,08 Å/pixeleko lagin-pixel tamainarekin (81.000x-ko handitze nominala) eta -0,8 eta -2,2 μm arteko defokatze-gradiente batekin. Bideo-grabaketa 40 fotograma segundoko abiaduran egin zen Latitude S mikroskopio bat (Gatan) erabiliz, 25 e–px−1 s−1-ko dosi-tasa nominalarekin, 2,4 s-ko esposizio-denborarekin eta gutxi gorabehera 60 e–Å−2-ko dosi totalarekin.
Izpi-induzitutako mugimenduaren zuzenketa eta dosi-ponderazioa filmean egin ziren MotionCor2 erabiliz RELION 4.061-en. Kontraste-transferentzia funtzioaren (CTF) parametroaren estimazioa cryoSPARC-en egin zen, adabakietan oinarritutako CTF estimazio-metodoa erabiliz62. CTF egokitzapen-bereizmena ≥4 Å zuten fotomikrografiak ondorengo analisietatik kanpo utzi ziren. Normalean, 500-1000 fotomikrografiako azpimultzo bat erabili zen cryoSPARC-en puntuen hautaketarako, eta ondoren, 2D sailkapen-txanda batzuk egin ziren iragazi ondoren, txantiloian oinarritutako partikula-hautaketarako erreferentzia-irudi garbi bat lortzeko. Ondoren, partikulak erauzi ziren 64 pixeleko muga-kutxak eta 4 aldizko multzokatzea erabiliz. 2D sailkapen-txanda batzuk egin ziren nahi ez diren partikula-kategoriak kentzeko. Hasierako 3D eredua ab initio berreraikuntza erabiliz berreraiki zen eta cryoSPARC-en fintze ez-uniformea erabiliz findu zen. 3D sailkapena cryoSPARC edo RELION-en egin zen ARD heterogeneotasunean oinarrituta. Ez zen mintz-domeinuen heterogeneotasun esanguratsurik ikusi. Partikulak C1 eta C2 metodoak erabiliz findu ziren; C2 bereizmen handiagoa zuten partikulak C2-rekiko simetrikotzat jo ziren eta RELIONera inportatu ziren Bayeseko fintze-prozesurako. Ondoren, partikulak cryoSPARCera itzuli ziren azken fintze ez-uniforme eta lokala lortzeko. Azken bereizmena eta partikula-kopuruak 1. taulan ageri dira.
Nan+AP pentameroak prozesatzerakoan, mintz-domeinuen bereizmena hobetzeko hainbat metodo aztertu genituen (batez ere poro-eskualdea), hala nola seinaleen kenketa eta TMD maskaratzea. Hala ere, saiakera hauek ez ziren arrakastatsuak izan, poro-eskualdean egon zitekeen desordena handiagatik eta TMDren heterogeneotasun orokorragatik. Azken bereizmena cryoSPARC-en prozesatzeko metodo ez-uniformeak automatikoki sortutako maskara bat erabiliz kalkulatu zen, batez ere ARD eskualdea helburu hartuta. Horrek mintz-domeinuena (batez ere VSLD eskualdea) baino bereizmen nabarmen handiagoa lortu zuen.
Nanchung eta Inactive intsektuen apo formen hasierako de novo ereduak Coot63 erabiliz sortu ziren lehenik, eta Nan eta Iav intsektuen ereduak AlphaFold264 erabiliz sortu ziren konfiantza baxuko eskualdeak identifikatzeko. Kalmodulinaren modelizazioa 4JPZ56 eta 1CFD65 PDB sarbideetan Ca2+ lotura duten eta Ca2+ gabeko ereduen gorputz zurrunen doikuntzetan oinarritu zen, hurrenez hurren. Ereduak fintze esferikoa erabiliz findu ziren estereokimika zuzena eta geometria ona bermatzeko. Ondoren, fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina eta fosfatidilserina lipido-dentsitate ondo definitu gisa modelatu ziren, eta NAM eta AP ligandoak dagokien dentsitateetan jarri ziren lotura estuetan. Murrizketa-fitxategiak isoformen SMILES katetik sortu ziren PHENIX66-n eLBOW erabiliz. Azkenik, ereduak espazio errealean findu ziren PHENIX-en, sare lokalaren bilaketa eta bigarren mailako egitura-murrizketekin minimizazio globala erabiliz. MolProbity zerbitzaria erabili zen eredua fintzeko eta egitura-analisia egiteko, eta ilustrazioak PyMOL eta UCSF Chimera X erabiliz egin ziren.67,68,69 Irekidura-analisia HOLE zerbitzaria erabiliz egin zen,70 eta sekuentzia-kontserbazio-mapak Consurf zerbitzaria erabiliz egin zen.71
Analisi estatistikoa Igor Pro 6.2, Excel Office 365 eta GraphPad Prism 7.0 erabiliz egin zen. Datu kuantitatibo guztiak batez besteko ± errore estandar (SEM) gisa aurkezten dira. Student-en t-testa (bi aldeetakoa, parekatu gabea) erabili zen bi talde alderatzeko. Bariantzaren analisi unidirekzionala (ANOVA) eta ondoren Dunnett-en post hoc testa erabili ziren hainbat talde alderatzeko. *P< 0,05, **P< 0,01, eta ***P< 0,001 balioak estatistikoki esanguratsutzat jo ziren, datuen banaketaren arabera. Kd eta Ki balioak eta haien % 95eko konfiantza-tarte asimetrikoak GraphPad Prism 10 erabiliz kalkulatu ziren.
Ikerketaren metodologiari buruzko xehetasun gehiago lortzeko, ikus artikulu honetan estekatutako Naturaren Portfolio Txostenaren Laburpena.
Hasierako eredua PDB 4JPZ eta 1CFD datu-baseetako kalmodulina ereduak erabiliz eraiki zen. Koordenatuak Protein Data Bank-en (PDB) gordailatu dira 9NVN (ligandorik gabeko Nan-Iav-CaM), 9NVO (nikotinamidari lotutako Nan-Iav-CaM), 9NVP (nikotinamidari eta EDTAri lotutako Nan-Iav-CaM), 9NVQ (afenidolpirrolinari eta kaltzioari lotutako Nan-Iav-CaM), 9NVR (afenidolpirrolinari eta EDTAri lotutako Nan-Iav-CaM) eta 9NVS (afenidolpirrolinari lotutako Nan pentameroa) zenbakiekin. Krio-mikroskopia elektronikoaren irudiak Mikroskopia Elektronikoaren Datu-basean (EMDB) gordailatu dira, honako sartze-zenbaki hauekin: EMD-49844 (ligandorik gabeko Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (nikotinamidarekin Nan-Iav-CaM konplexua), EMD-49846 (nikotinamida eta EDTArekin Nan-Iav-CaM konplexua), EMD-49847 (afidopirrolina eta kaltzioarekin Nan-Iav-CaM konplexua), EMD-49848 (afidopirrolina eta EDTArekin Nan-Iav-CaM konplexua), eta EMD-49849 (afidopirrolinarekin Nan pentamero konplexua). Artikulu honetan, analisi funtzionalerako datu gordinak aurkezten dira.
Argitaratze data: 2026ko urtarrilaren 28a